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    沉默β-catenin表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響與作用機(jī)制研究

    2018-06-14 03:00:14潘安萍朱建偉王忻妍
    浙江醫(yī)學(xué) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期染色胃癌

    潘安萍 朱建偉 王忻妍

    β-鏈蛋白(β-catenin)是一種多功能的蛋白質(zhì)。在正常細(xì)胞內(nèi),β-catenin多數(shù)位于細(xì)胞膜,與E鈣黏蛋白及α-catenin一起在細(xì)胞間的黏附中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。β-catenin若脫離細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),易被降解,但當(dāng)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生降解異常時(shí),β-catenin會在細(xì)胞內(nèi)堆積,進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,即β-catenin的另一重要功能-參與Wnt信號通路[2]。β-catenin下游靶基因編碼許多調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)蛋白,如 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7等,即β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子有可能影響細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為,且有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在多種腫瘤細(xì)胞中明顯高表達(dá)[3]?;诖?,本研究應(yīng)用干擾慢病毒感染β-catenin相對高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MGC-803,沉默其細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá),而后通過多種實(shí)驗(yàn)方法觀察β-catenin表達(dá)下調(diào)對MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響,同時(shí)檢測沉默β-catenin表達(dá)后的MGC-803細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cyclin D1和MMP-7等蛋白表達(dá)水平的變化,初步探討β-catenin下調(diào)影響胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為可能的作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞與主要試劑 MGC-803細(xì)胞株購自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、βcatenin-Neg慢病毒液購于上海吉瑪公司;凋亡檢測AnnexinV-PE/7-AAD試劑盒、細(xì)胞周期碘化丙啶(PI)染色試劑盒購于南京凱基生物有限公司;Matrigel膠購于美國BD公司;兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Santan Cruz公司;鼠抗人β-actin、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP單克隆抗體均購于中杉金橋公司。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 分別將購買的β-catenin-RNAi慢病毒及β-catenin-Neg慢病毒感染MGC-803細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組(感染β-catenin-RNAi慢病毒的MGC-803-RNAi細(xì)胞)、陰性對照組(感染空載慢病毒的MGC-803-Neg細(xì)胞)、空白對照組(未處理的MGC-803細(xì)胞)。

    1.2.2 病毒感染與細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知該病毒對MGC-803細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)約為100,將MGC-803細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組細(xì)胞分別滴加相應(yīng)慢病毒液,空白對照組加等體積培養(yǎng)基。24h后換液,3d后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色情況。感染效率=帶綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.2.3 Western blot檢測細(xì)胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7表達(dá)水平 用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞內(nèi)的總蛋白,分別取20μl進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳,結(jié)束后目的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜,5%的脫脂奶粉封閉1h,一抗(1:1 000)4℃封閉過夜,二抗(1:2 500)室溫封閉1h。暗室內(nèi)用發(fā)光液進(jìn)行曝光、顯影、定影,得到目的蛋白條帶的膠片,用Image J軟件檢測各組細(xì)胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.2.4 Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 將各組細(xì)胞分別接種于6cm培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至約80%~90%融合度時(shí)收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入1 μl Annexin V-PE染液,室溫、避光、反應(yīng)15min,加入5 μl 7-AAD染液,室溫、避光、反應(yīng)15min。過300目尼龍網(wǎng)后1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.2.5 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期 取各組細(xì)胞分別接種于6cm培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞長至約80%~90%融合度時(shí)收取細(xì)胞,每組細(xì)胞取約1×105個(gè)。用PBS清洗2次后用預(yù)冷的75%乙醇溶液1ml重懸細(xì)胞沉淀,4℃固定過夜。第2天1 000r/min離心5min后去固定液,PBS清洗2次,加入100μl的RNase A重懸細(xì)胞沉淀,置于37℃水浴鍋內(nèi)30 min,加入PI染料400μl,4℃避光染色30min。過300目尼龍網(wǎng)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.2.6 Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力 將融好的Mtrigel膠與含10%BSA的1640培養(yǎng)基按體積比1:6混合,后取50μl平鋪于小室的上室面。收集各組細(xì)胞,PBS清洗2次,用完全培養(yǎng)基稀釋成1×105/ml的細(xì)胞懸液。小室的下室面各加入含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基500μl,上室面加入200μl各組細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24h后取出小室,擦拭上室面未穿膜的細(xì)胞后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)分析細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況、β-catenin 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、侵襲能力,以及Bcl-2、Bax、cyclin D1、MMP-7 蛋白表達(dá)水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以表示,3組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況比較 感染4d后,熒光顯微鏡下可見MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞顯示強(qiáng)綠色熒光,且?guī)ЬG色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例均超過80%,而MGC-803細(xì)胞無綠色熒光,即MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞慢病毒感染效率>80%。MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況見圖1(插頁)。

    圖1 MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光顯微鏡下所見(×100)

    2.2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin相對表達(dá)水平分別為0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164,3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平較MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞下調(diào)(均P<0.05),而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 β-catenin蛋白電泳圖比較見圖2。

    圖2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 β-catenin蛋白電泳圖比較(a:MGC-803 細(xì)胞;b:MGC-803-Neg細(xì)胞;c:MGC-803-RNAi細(xì)胞)

    2.3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率分別為(1.20±0.26)%、(1.35±0.35)%、(8.52±0.82)%,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率高于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而 MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較見圖3。

    圖3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較(a:MGC-803 細(xì)胞;b:MGC-803-Neg細(xì)胞;c:MGC-803-RNAi細(xì)胞)

    2.4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期比較 以S/G1期細(xì)胞比例為觀察指標(biāo),MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞分別為 (1.11±0.05)%、(1.09±0.10)%、(0.78±0.08)%,3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞 S/G1期比例低于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期結(jié)果比較見圖4(插頁)。

    圖4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期結(jié)果比較(a:MGC803 細(xì)胞;b:MGC803-Neg細(xì)胞;c:MGC803-RNAi細(xì)胞)

    2.5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞穿膜染色數(shù)分別為(109.80±5.36)、(104.40±7.47)、(54.00±6.28)個(gè),3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力低于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而 MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Transwell法檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5(插頁)。

    圖5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi穿膜細(xì)胞顯微鏡下所見比較(a:MGC803 細(xì)胞;b:MGC803-Neg 細(xì)胞;c:MGC803-RNAi細(xì)胞;結(jié)晶紫染色,×200)

    2.6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi 細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7蛋白表達(dá)水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2、cyclin D1、MMP-7蛋白表達(dá)水平均低于MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平高于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05)。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7 蛋白電泳圖比較見圖6。

    3 討論

    β-catenin是一種多功能、進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)分子,在多細(xì)胞生物的胚胎發(fā)育及機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,一方面β-catenin作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子,能介導(dǎo)多種原癌基因與細(xì)胞周期調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,抑制細(xì)胞分化、凋亡,還能誘導(dǎo)腫瘤耐藥,另一方面,腫瘤細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的異常定位導(dǎo)致細(xì)胞膜上β-catenin含量下降,易使癌細(xì)胞間黏附功能下降,致腫瘤細(xì)胞更易于脫離原發(fā)部位而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。β-catenin參與調(diào)控上述生物學(xué)行為的靶基因編碼蛋白包含 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、MMP-7、P-gp等[3]。本研究選取β-catenin相對高表達(dá)的胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過干擾慢病毒感染MGC-803細(xì)胞,經(jīng)感染成功的MGC-803細(xì)胞在熒光顯微鏡下有明顯的熒光顯示;并通過Western blot法證實(shí)MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平明顯下調(diào)。本研究再將此穩(wěn)定穿代的3株細(xì)胞(MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg及MGC-803細(xì)胞)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),以了解βcatenin表達(dá)下調(diào)對MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的作用機(jī)制。

    圖6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白電泳圖比較(a:MGC-803細(xì)胞;b:MGC-803-Neg細(xì)胞;c:MGC-803-RNAi細(xì)胞)

    本研究采用Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)β-catenin表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)MGC-803細(xì)胞凋亡。這與在腸癌細(xì)胞中得到的結(jié)果一致[4]。細(xì)胞凋亡過程主要受Bcl-2蛋白家族所調(diào)控,其中最具代表性的為Bax及Bcl-2蛋白,Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[5]。本研究檢測到沉默β-catenin表達(dá)之后的MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào),而Bax表達(dá)水平則相對上調(diào),結(jié)果同預(yù)期。筆者推測,β-catenin表達(dá)異常對MGC-803細(xì)胞凋亡的影響,其機(jī)制與影響Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白Bax及Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。cyclin是一類在細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的蛋白,其中cyclin D1能調(diào)細(xì)胞周期由G1期順利進(jìn)入到S期[6]。本研究干擾MGC-803細(xì)胞β-catenin的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MGC-803-RNAi細(xì)胞cyclin D1表達(dá)水平也下調(diào),且出現(xiàn)明顯的G1期阻滯,細(xì)胞增殖減弱。這與Shtutman等[7]研究結(jié)果相符。筆者推論,沉默β-catenin表達(dá)使MGC-803細(xì)胞阻滯在G1期,其作用機(jī)制與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白cyclin D1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

    胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌患者治療失敗的主要原因。β-catenin作為細(xì)胞黏附中的關(guān)鍵因子,當(dāng)其在細(xì)胞膜中減少時(shí),細(xì)胞間黏附功能下降,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易脫離原發(fā)部位。但是游離出來的腫瘤細(xì)胞要在細(xì)胞間質(zhì)中進(jìn)行遷徙,必須能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)。在細(xì)胞外基質(zhì)的眾酶中,MMP起著關(guān)鍵的作用[8]。研究顯示,MMP家族蛋白酶的表達(dá)受Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控,其中MMP-7蛋白與腫瘤關(guān)系最密切,MMP-7普遍被發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織及細(xì)胞中明顯高表達(dá),且MMP-7在相對晚期的胃癌組織中陽性率明顯高于相對早期的胃癌組織[9]。本研究通過Transwell實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn),沉默β-catenin表達(dá)之后,MGC-803-RNAi細(xì)胞的侵襲力顯著下降,且MGC-803-RNAi細(xì)胞內(nèi)MMP-7的表達(dá)水平也明顯下降。因此推論β-catenin沉默抑制MGC-803細(xì)胞侵襲能力與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白MMP-7表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。這一結(jié)果與在腸癌、食管癌中的研究相似[10]。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示,β-catenin表達(dá)下調(diào)可影響胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等多種生物學(xué)行為,其作用機(jī)制可能與影響Wnt/β-catenin信號通路下游多種靶蛋白表達(dá)有關(guān)。

    [1]Archbold HC,Yang YX,Chen L,et al.How do they do Wnt they do?:regulation of transcription by the Wnt/β-catenin pathway[J].Acta Physiologica,2012,204(1):74.

    [2]Hecht A,Litterst CM,Huber O,et al.Functional characterization of multiple transactivating elements in beta-catenin,some of which interact with the 1'ATA-binding protein in vitro[J].J Biol Chem,1999,274(25):18017-18025.

    [3]Polakis P.Wnt signaling and cancer[J].Genes&Development,2000,14(15):1837-1851.

    [4]Lu W,Jia G,Meng X,et al.Beta-catenin mediates the apoptosis induction effect of celastrol in HT29 cells[J].Life sciences,2012,91(7):279-283.

    [5]Hancock JT,Desikan R,Neill SJ.Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways[J].Biochemical Society Transactions,2001,29(2):345-349.

    [6]Brunelle JK,Letai A.Control of mitochondrial apoptosis by the Bcl-2 family[J].Journal of cell science,2009,122(4):437-441.

    [7]Shtutman M,Zhurinsky J,Simcha I,et al.The cyclin D1 gene is a target of the β-catenin/LEF-1 pathway[J].Proceedings of the National A-cademyof Sciences,1999,96(10):5522-5527.

    [8]Deryugina EI,Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis[J].Cancer and Metastasis Reviews,2006,25(1):9-34.

    [9]Brabletz T,Jung A,Dag S,et al.β-catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinase-7 in human colorectal cancer[J].The American journal of pathology,1999,155(4):1033-1038.

    [10]Minamoto T,Ougolkov A,Yamashita K,et al.Oncogenic beta-catenin and MMP-7(matrilysin)cosegregate in late stage clinical colon cancer[J].Proceedings of the American Association for Cancer Research,2004,2004(1):1170.

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