• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    沉默β-catenin表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響與作用機(jī)制研究

    2018-06-14 03:00:14潘安萍朱建偉王忻妍
    浙江醫(yī)學(xué) 2018年9期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞周期染色胃癌

    潘安萍 朱建偉 王忻妍

    β-鏈蛋白(β-catenin)是一種多功能的蛋白質(zhì)。在正常細(xì)胞內(nèi),β-catenin多數(shù)位于細(xì)胞膜,與E鈣黏蛋白及α-catenin一起在細(xì)胞間的黏附中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。β-catenin若脫離細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),易被降解,但當(dāng)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生降解異常時(shí),β-catenin會在細(xì)胞內(nèi)堆積,進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,即β-catenin的另一重要功能-參與Wnt信號通路[2]。β-catenin下游靶基因編碼許多調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)蛋白,如 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-7等,即β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子有可能影響細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為,且有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在多種腫瘤細(xì)胞中明顯高表達(dá)[3]?;诖?,本研究應(yīng)用干擾慢病毒感染β-catenin相對高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MGC-803,沉默其細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá),而后通過多種實(shí)驗(yàn)方法觀察β-catenin表達(dá)下調(diào)對MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響,同時(shí)檢測沉默β-catenin表達(dá)后的MGC-803細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cyclin D1和MMP-7等蛋白表達(dá)水平的變化,初步探討β-catenin下調(diào)影響胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為可能的作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞與主要試劑 MGC-803細(xì)胞株購自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、βcatenin-Neg慢病毒液購于上海吉瑪公司;凋亡檢測AnnexinV-PE/7-AAD試劑盒、細(xì)胞周期碘化丙啶(PI)染色試劑盒購于南京凱基生物有限公司;Matrigel膠購于美國BD公司;兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Santan Cruz公司;鼠抗人β-actin、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP單克隆抗體均購于中杉金橋公司。

    1.2 方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 分別將購買的β-catenin-RNAi慢病毒及β-catenin-Neg慢病毒感染MGC-803細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組(感染β-catenin-RNAi慢病毒的MGC-803-RNAi細(xì)胞)、陰性對照組(感染空載慢病毒的MGC-803-Neg細(xì)胞)、空白對照組(未處理的MGC-803細(xì)胞)。

    1.2.2 病毒感染與細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知該病毒對MGC-803細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)約為100,將MGC-803細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組細(xì)胞分別滴加相應(yīng)慢病毒液,空白對照組加等體積培養(yǎng)基。24h后換液,3d后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色情況。感染效率=帶綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.2.3 Western blot檢測細(xì)胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7表達(dá)水平 用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞內(nèi)的總蛋白,分別取20μl進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳,結(jié)束后目的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜,5%的脫脂奶粉封閉1h,一抗(1:1 000)4℃封閉過夜,二抗(1:2 500)室溫封閉1h。暗室內(nèi)用發(fā)光液進(jìn)行曝光、顯影、定影,得到目的蛋白條帶的膠片,用Image J軟件檢測各組細(xì)胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.2.4 Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 將各組細(xì)胞分別接種于6cm培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至約80%~90%融合度時(shí)收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入1 μl Annexin V-PE染液,室溫、避光、反應(yīng)15min,加入5 μl 7-AAD染液,室溫、避光、反應(yīng)15min。過300目尼龍網(wǎng)后1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.2.5 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期 取各組細(xì)胞分別接種于6cm培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞長至約80%~90%融合度時(shí)收取細(xì)胞,每組細(xì)胞取約1×105個(gè)。用PBS清洗2次后用預(yù)冷的75%乙醇溶液1ml重懸細(xì)胞沉淀,4℃固定過夜。第2天1 000r/min離心5min后去固定液,PBS清洗2次,加入100μl的RNase A重懸細(xì)胞沉淀,置于37℃水浴鍋內(nèi)30 min,加入PI染料400μl,4℃避光染色30min。過300目尼龍網(wǎng)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.2.6 Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力 將融好的Mtrigel膠與含10%BSA的1640培養(yǎng)基按體積比1:6混合,后取50μl平鋪于小室的上室面。收集各組細(xì)胞,PBS清洗2次,用完全培養(yǎng)基稀釋成1×105/ml的細(xì)胞懸液。小室的下室面各加入含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基500μl,上室面加入200μl各組細(xì)胞懸液,培養(yǎng)24h后取出小室,擦拭上室面未穿膜的細(xì)胞后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)分析細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

    1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況、β-catenin 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、侵襲能力,以及Bcl-2、Bax、cyclin D1、MMP-7 蛋白表達(dá)水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以表示,3組比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況比較 感染4d后,熒光顯微鏡下可見MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞顯示強(qiáng)綠色熒光,且?guī)ЬG色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例均超過80%,而MGC-803細(xì)胞無綠色熒光,即MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞慢病毒感染效率>80%。MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況見圖1(插頁)。

    圖1 MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光顯微鏡下所見(×100)

    2.2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin相對表達(dá)水平分別為0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164,3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平較MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞下調(diào)(均P<0.05),而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 β-catenin蛋白電泳圖比較見圖2。

    圖2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 β-catenin蛋白電泳圖比較(a:MGC-803 細(xì)胞;b:MGC-803-Neg細(xì)胞;c:MGC-803-RNAi細(xì)胞)

    2.3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率分別為(1.20±0.26)%、(1.35±0.35)%、(8.52±0.82)%,3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率高于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而 MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較見圖3。

    圖3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較(a:MGC-803 細(xì)胞;b:MGC-803-Neg細(xì)胞;c:MGC-803-RNAi細(xì)胞)

    2.4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期比較 以S/G1期細(xì)胞比例為觀察指標(biāo),MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞分別為 (1.11±0.05)%、(1.09±0.10)%、(0.78±0.08)%,3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞 S/G1期比例低于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期結(jié)果比較見圖4(插頁)。

    圖4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期結(jié)果比較(a:MGC803 細(xì)胞;b:MGC803-Neg細(xì)胞;c:MGC803-RNAi細(xì)胞)

    2.5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞穿膜染色數(shù)分別為(109.80±5.36)、(104.40±7.47)、(54.00±6.28)個(gè),3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力低于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而 MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Transwell法檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5(插頁)。

    圖5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi穿膜細(xì)胞顯微鏡下所見比較(a:MGC803 細(xì)胞;b:MGC803-Neg 細(xì)胞;c:MGC803-RNAi細(xì)胞;結(jié)晶紫染色,×200)

    2.6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi 細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7蛋白表達(dá)水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2、cyclin D1、MMP-7蛋白表達(dá)水平均低于MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平高于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞(均P<0.05),而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P >0.05)。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7 蛋白電泳圖比較見圖6。

    3 討論

    β-catenin是一種多功能、進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)分子,在多細(xì)胞生物的胚胎發(fā)育及機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,一方面β-catenin作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子,能介導(dǎo)多種原癌基因與細(xì)胞周期調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯,促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移,抑制細(xì)胞分化、凋亡,還能誘導(dǎo)腫瘤耐藥,另一方面,腫瘤細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的異常定位導(dǎo)致細(xì)胞膜上β-catenin含量下降,易使癌細(xì)胞間黏附功能下降,致腫瘤細(xì)胞更易于脫離原發(fā)部位而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。β-catenin參與調(diào)控上述生物學(xué)行為的靶基因編碼蛋白包含 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、MMP-7、P-gp等[3]。本研究選取β-catenin相對高表達(dá)的胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過干擾慢病毒感染MGC-803細(xì)胞,經(jīng)感染成功的MGC-803細(xì)胞在熒光顯微鏡下有明顯的熒光顯示;并通過Western blot法證實(shí)MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平明顯下調(diào)。本研究再將此穩(wěn)定穿代的3株細(xì)胞(MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg及MGC-803細(xì)胞)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),以了解βcatenin表達(dá)下調(diào)對MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的作用機(jī)制。

    圖6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白電泳圖比較(a:MGC-803細(xì)胞;b:MGC-803-Neg細(xì)胞;c:MGC-803-RNAi細(xì)胞)

    本研究采用Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)β-catenin表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)MGC-803細(xì)胞凋亡。這與在腸癌細(xì)胞中得到的結(jié)果一致[4]。細(xì)胞凋亡過程主要受Bcl-2蛋白家族所調(diào)控,其中最具代表性的為Bax及Bcl-2蛋白,Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[5]。本研究檢測到沉默β-catenin表達(dá)之后的MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào),而Bax表達(dá)水平則相對上調(diào),結(jié)果同預(yù)期。筆者推測,β-catenin表達(dá)異常對MGC-803細(xì)胞凋亡的影響,其機(jī)制與影響Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白Bax及Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。cyclin是一類在細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的蛋白,其中cyclin D1能調(diào)細(xì)胞周期由G1期順利進(jìn)入到S期[6]。本研究干擾MGC-803細(xì)胞β-catenin的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MGC-803-RNAi細(xì)胞cyclin D1表達(dá)水平也下調(diào),且出現(xiàn)明顯的G1期阻滯,細(xì)胞增殖減弱。這與Shtutman等[7]研究結(jié)果相符。筆者推論,沉默β-catenin表達(dá)使MGC-803細(xì)胞阻滯在G1期,其作用機(jī)制與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白cyclin D1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

    胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌患者治療失敗的主要原因。β-catenin作為細(xì)胞黏附中的關(guān)鍵因子,當(dāng)其在細(xì)胞膜中減少時(shí),細(xì)胞間黏附功能下降,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易脫離原發(fā)部位。但是游離出來的腫瘤細(xì)胞要在細(xì)胞間質(zhì)中進(jìn)行遷徙,必須能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)。在細(xì)胞外基質(zhì)的眾酶中,MMP起著關(guān)鍵的作用[8]。研究顯示,MMP家族蛋白酶的表達(dá)受Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控,其中MMP-7蛋白與腫瘤關(guān)系最密切,MMP-7普遍被發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織及細(xì)胞中明顯高表達(dá),且MMP-7在相對晚期的胃癌組織中陽性率明顯高于相對早期的胃癌組織[9]。本研究通過Transwell實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn),沉默β-catenin表達(dá)之后,MGC-803-RNAi細(xì)胞的侵襲力顯著下降,且MGC-803-RNAi細(xì)胞內(nèi)MMP-7的表達(dá)水平也明顯下降。因此推論β-catenin沉默抑制MGC-803細(xì)胞侵襲能力與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白MMP-7表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。這一結(jié)果與在腸癌、食管癌中的研究相似[10]。

    綜上所述,本研究結(jié)果顯示,β-catenin表達(dá)下調(diào)可影響胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等多種生物學(xué)行為,其作用機(jī)制可能與影響Wnt/β-catenin信號通路下游多種靶蛋白表達(dá)有關(guān)。

    [1]Archbold HC,Yang YX,Chen L,et al.How do they do Wnt they do?:regulation of transcription by the Wnt/β-catenin pathway[J].Acta Physiologica,2012,204(1):74.

    [2]Hecht A,Litterst CM,Huber O,et al.Functional characterization of multiple transactivating elements in beta-catenin,some of which interact with the 1'ATA-binding protein in vitro[J].J Biol Chem,1999,274(25):18017-18025.

    [3]Polakis P.Wnt signaling and cancer[J].Genes&Development,2000,14(15):1837-1851.

    [4]Lu W,Jia G,Meng X,et al.Beta-catenin mediates the apoptosis induction effect of celastrol in HT29 cells[J].Life sciences,2012,91(7):279-283.

    [5]Hancock JT,Desikan R,Neill SJ.Role of reactive oxygen species in cell signalling pathways[J].Biochemical Society Transactions,2001,29(2):345-349.

    [6]Brunelle JK,Letai A.Control of mitochondrial apoptosis by the Bcl-2 family[J].Journal of cell science,2009,122(4):437-441.

    [7]Shtutman M,Zhurinsky J,Simcha I,et al.The cyclin D1 gene is a target of the β-catenin/LEF-1 pathway[J].Proceedings of the National A-cademyof Sciences,1999,96(10):5522-5527.

    [8]Deryugina EI,Quigley JP.Matrix metalloproteinases and tumor metastasis[J].Cancer and Metastasis Reviews,2006,25(1):9-34.

    [9]Brabletz T,Jung A,Dag S,et al.β-catenin regulates the expression of the matrix metalloproteinase-7 in human colorectal cancer[J].The American journal of pathology,1999,155(4):1033-1038.

    [10]Minamoto T,Ougolkov A,Yamashita K,et al.Oncogenic beta-catenin and MMP-7(matrilysin)cosegregate in late stage clinical colon cancer[J].Proceedings of the American Association for Cancer Research,2004,2004(1):1170.

    猜你喜歡
    細(xì)胞周期染色胃癌
    紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
    平面圖的3-hued 染色
    簡單圖mC4的點(diǎn)可區(qū)別V-全染色
    NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
    X線照射劑量率對A549肺癌細(xì)胞周期的影響
    油紅O染色在斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    P53及Ki67在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義
    胃癌組織中LKB1和VEGF-C的表達(dá)及其意義
    熊果酸對肺癌細(xì)胞株A549及SPCA1細(xì)胞周期的抑制作用
    胃癌組織中VEGF和ILK的表達(dá)及意義
    欧美绝顶高潮抽搐喷水| 99国产精品一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 精品高清国产在线一区| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品 国内视频| 一二三四社区在线视频社区8| 涩涩av久久男人的天堂| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成人av激情在线播放| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 午夜影院日韩av| 亚洲中文字幕日韩| 成人三级做爰电影| av视频在线观看入口| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜激情av网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美中文综合在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久性视频一级片| 这个男人来自地球电影免费观看| 制服丝袜大香蕉在线| 变态另类丝袜制服| 88av欧美| 无限看片的www在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产私拍福利视频在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 韩国精品一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲人成77777在线视频| 久久国产精品影院| 国产色视频综合| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲自拍偷在线| 亚洲全国av大片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日韩精品网址| 91在线观看av| 亚洲国产欧美网| 人人澡人人妻人| www.精华液| 亚洲精品国产一区二区精华液| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜福利在线观看吧| 精品国产乱码久久久久久男人| 在线天堂中文资源库| 日本 av在线| 久久久国产欧美日韩av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品 欧美亚洲| 99在线视频只有这里精品首页| 精品久久久久久久毛片微露脸| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久婷婷成人综合色麻豆| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产高清视频在线播放一区| 国产三级黄色录像| 男人的好看免费观看在线视频 | 丝袜在线中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 久久久国产成人免费| 黄片播放在线免费| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久中文字幕人妻熟女| 99久久综合精品五月天人人| 美女国产高潮福利片在线看| 欧美午夜高清在线| 男人操女人黄网站| 亚洲国产欧美网| 国产av在哪里看| 国产三级黄色录像| 少妇的丰满在线观看| 咕卡用的链子| 男人舔女人下体高潮全视频| 视频在线观看一区二区三区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品国产清高在天天线| 久久久国产成人免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 岛国视频午夜一区免费看| 香蕉国产在线看| 日韩高清综合在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 一进一出抽搐gif免费好疼| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99精品久久久久人妻精品| 99精品在免费线老司机午夜| 乱人伦中国视频| 极品教师在线免费播放| 国产亚洲欧美精品永久| 在线观看免费视频日本深夜| 天堂√8在线中文| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 91九色精品人成在线观看| 男女午夜视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产97色在线日韩免费| 国产乱人伦免费视频| 国产高清激情床上av| 中亚洲国语对白在线视频| 伦理电影免费视频| 大型黄色视频在线免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 色av中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产免费av片在线观看野外av| 十八禁人妻一区二区| 人人澡人人妻人| 欧美一区二区精品小视频在线| 91成年电影在线观看| 性少妇av在线| 午夜激情av网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| netflix在线观看网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲精品久久国产高清桃花| 91精品国产国语对白视频| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 在线播放国产精品三级| 午夜视频精品福利| 精品免费久久久久久久清纯| 久久热在线av| 涩涩av久久男人的天堂| 1024视频免费在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 色在线成人网| 日韩高清综合在线| 9191精品国产免费久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一进一出抽搐动态| 美女国产高潮福利片在线看| 国产黄a三级三级三级人| 久久这里只有精品19| 美国免费a级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜福利在线观看吧| 怎么达到女性高潮| 日本欧美视频一区| 成年人黄色毛片网站| 看片在线看免费视频| 国产av在哪里看| 免费人成视频x8x8入口观看| 黄色毛片三级朝国网站| 国产主播在线观看一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 一本综合久久免费| 国产精品,欧美在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲欧美激情综合另类| 麻豆成人av在线观看| 亚洲久久久国产精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 无限看片的www在线观看| 亚洲片人在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲最大成人中文| 天堂√8在线中文| 国产亚洲欧美98| 麻豆一二三区av精品| 香蕉久久夜色| 电影成人av| 在线观看免费午夜福利视频| 91麻豆av在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久久久国产a免费观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩有码中文字幕| 日本在线视频免费播放| av电影中文网址| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品国产区一区二| 久久国产乱子伦精品免费另类| 神马国产精品三级电影在线观看 | 美国免费a级毛片| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆av在线久日| 日本在线视频免费播放| 色老头精品视频在线观看| 一区福利在线观看| 日本 欧美在线| 国产精品一区二区免费欧美| 老汉色∧v一级毛片| 在线天堂中文资源库| aaaaa片日本免费| 黄色丝袜av网址大全| 日日爽夜夜爽网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜福利影视在线免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲久久久国产精品| 91成人精品电影| 国语自产精品视频在线第100页| 淫妇啪啪啪对白视频| aaaaa片日本免费| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲五月天丁香| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产三级在线视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美一区二区精品小视频在线| 757午夜福利合集在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 色老头精品视频在线观看| 中文字幕久久专区| 99久久综合精品五月天人人| 国产色视频综合| 久久人妻熟女aⅴ| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久国产欧美日韩av| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲国产欧美网| 久久国产精品人妻蜜桃| aaaaa片日本免费| 久久性视频一级片| 国产亚洲精品久久久久5区| 99热只有精品国产| 国产野战对白在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 美国免费a级毛片| 亚洲情色 制服丝袜| 女人被狂操c到高潮| 久久午夜亚洲精品久久| 两个人视频免费观看高清| 黄色视频不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 国语自产精品视频在线第100页| 看片在线看免费视频| 国产av一区在线观看免费| 精品无人区乱码1区二区| a在线观看视频网站| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲国产看品久久| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 91成年电影在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产99白浆流出| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| 怎么达到女性高潮| www.熟女人妻精品国产| 狂野欧美激情性xxxx| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲人成电影观看| 国产高清有码在线观看视频 | 天天添夜夜摸| 岛国视频午夜一区免费看| 日本 av在线| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 999久久久国产精品视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜日韩欧美国产| 免费在线观看日本一区| 午夜久久久久精精品| 色av中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| 一进一出抽搐动态| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久久久久久久久大奶| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 欧美日本中文国产一区发布| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 在线观看免费日韩欧美大片| 久久亚洲真实| 香蕉丝袜av| or卡值多少钱| 久久久国产精品麻豆| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 色精品久久人妻99蜜桃| 日本免费a在线| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日本免费a在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产激情久久老熟女| 亚洲av片天天在线观看| 欧美成人午夜精品| 国产成人系列免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 十八禁人妻一区二区| 久久九九热精品免费| 好男人在线观看高清免费视频 | 成在线人永久免费视频| 久久久精品欧美日韩精品| 女性生殖器流出的白浆| 国产黄a三级三级三级人| 黄色视频不卡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 色综合站精品国产| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久久久久久久久大奶| 国产区一区二久久| 99国产精品99久久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 在线观看免费视频日本深夜| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 黄色 视频免费看| 好男人电影高清在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 村上凉子中文字幕在线| 欧美在线黄色| 亚洲片人在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 88av欧美| videosex国产| 日韩视频一区二区在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 大型av网站在线播放| 亚洲精华国产精华精| 成人手机av| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 最新在线观看一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费在线观看日本一区| 看黄色毛片网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 少妇 在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲国产看品久久| 午夜福利,免费看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 国产精品免费视频内射| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜福利高清视频| 丁香欧美五月| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲中文av在线| 91av网站免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美乱妇无乱码| x7x7x7水蜜桃| 久久久久国产一级毛片高清牌| 高清在线国产一区| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品国产亚洲在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 免费av毛片视频| 女性生殖器流出的白浆| 大型av网站在线播放| 好男人在线观看高清免费视频 | a级毛片在线看网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 黄色 视频免费看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜福利免费观看在线| 黄频高清免费视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 两人在一起打扑克的视频| 国产色视频综合| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲第一电影网av| 亚洲av片天天在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 日本五十路高清| 欧美激情 高清一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美在线一区亚洲| 天堂影院成人在线观看| 美女大奶头视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲情色 制服丝袜| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 一级a爱片免费观看的视频| www.999成人在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人手机av| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久 成人 亚洲| 久久国产精品影院| 亚洲自拍偷在线| 在线天堂中文资源库| 亚洲五月天丁香| 在线av久久热| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| av天堂在线播放| 亚洲久久久国产精品| 亚洲黑人精品在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 99国产精品一区二区三区| 少妇粗大呻吟视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产av又大| 伦理电影免费视频| 天天一区二区日本电影三级 | 欧美成人性av电影在线观看| 人人妻人人澡人人看| 国产在线精品亚洲第一网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| av网站免费在线观看视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 69av精品久久久久久| 国产片内射在线| 999久久久国产精品视频| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 一级黄色大片毛片| 日韩欧美一区视频在线观看| 香蕉丝袜av| 国产亚洲欧美98| 国产亚洲精品av在线| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲成av人片免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲国产看品久久| 久久人妻熟女aⅴ| 在线av久久热| 亚洲专区字幕在线| 久久人人精品亚洲av| 美女高潮到喷水免费观看| 波多野结衣一区麻豆| 国内精品久久久久精免费| 激情视频va一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 女人被狂操c到高潮| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 99国产综合亚洲精品| 久久这里只有精品19| 麻豆一二三区av精品| 自线自在国产av| 1024香蕉在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 在线观看免费视频网站a站| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲无线在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 黑人操中国人逼视频| 午夜免费成人在线视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲专区字幕在线| 国产一区在线观看成人免费| 69av精品久久久久久| 69av精品久久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 老司机在亚洲福利影院| 一区福利在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 搞女人的毛片| 国产主播在线观看一区二区| 最近最新免费中文字幕在线| av天堂久久9| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产成人av教育| 国产伦一二天堂av在线观看| 美女午夜性视频免费| 午夜福利在线观看吧| 黄片播放在线免费| 亚洲专区中文字幕在线| 久久中文字幕一级| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 国产成人av教育| 天天一区二区日本电影三级 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 咕卡用的链子| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 一级毛片高清免费大全| 美女免费视频网站| 丝袜人妻中文字幕| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一级,二级,三级黄色视频| 看免费av毛片| 在线视频色国产色| 亚洲五月天丁香| 国产精品电影一区二区三区| 午夜福利18| 中亚洲国语对白在线视频| 国产99久久九九免费精品| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久国内视频| 一级毛片女人18水好多| 涩涩av久久男人的天堂| 一级,二级,三级黄色视频| 免费在线观看日本一区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| www.www免费av| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜亚洲福利在线播放| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 日本一区二区免费在线视频| 手机成人av网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品一品国产午夜福利视频| 成人手机av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品一区二区三区四区久久 | av视频免费观看在线观看| 69精品国产乱码久久久| 激情在线观看视频在线高清| 日韩三级视频一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 午夜亚洲福利在线播放| 中文字幕久久专区| 国产主播在线观看一区二区| 精品国产一区二区久久| 亚洲欧美激情在线| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品电影一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲国产精品999在线| 满18在线观看网站| 热re99久久国产66热| 亚洲 国产 在线| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美乱色亚洲激情| 国产一区二区激情短视频| 级片在线观看| 国产三级在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品第一国产精品| 一区福利在线观看| 在线av久久热| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精华一区二区三区| 手机成人av网站| 日韩欧美免费精品| 国产精品电影一区二区三区| 一进一出好大好爽视频| 久久久国产成人精品二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 1024视频免费在线观看| 国产熟女xx| 亚洲无线在线观看| 免费观看精品视频网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美成人性av电影在线观看| 曰老女人黄片| 大型av网站在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 少妇 在线观看| 日韩高清综合在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲成av人片免费观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| cao死你这个sao货| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片|