微生物集群效應(yīng)的固定化酵母生產(chǎn)燃料乙醇

羅 虎,劉慶國(guó),陳 勇,孫振江,李永恒,許旺發(fā)

(1.廣西中糧生物質(zhì)能源有限公司，廣西 北海 536100；2.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司，江蘇 南京 210032)

由于石油資源和其他化石能源的過(guò)度開采，能源危機(jī)已成為世界性的問(wèn)題，尋找清潔可再生能源是當(dāng)今最為迫切的任務(wù)[1]。生物乙醇是通過(guò)生物質(zhì)(如糖蜜、玉米或秸稈纖維素等)進(jìn)行生物厭氧發(fā)酵制得，具有無(wú)污染、可再生性等優(yōu)點(diǎn)[2]；而且它能與汽油以任意比例混合，可有效替代部分石油資源，從而降低對(duì)石油需求的壓力。在我國(guó)燃料乙醇工業(yè)生產(chǎn)中，二代纖維乙醇受高成本的預(yù)處理技術(shù)影響，限制了大規(guī)模生產(chǎn)，木薯和玉米依然是乙醇發(fā)酵的兩大主要發(fā)酵原料[3]。

目前,國(guó)內(nèi)主流的乙醇發(fā)酵工藝幾乎都是大接種量的游離發(fā)酵工藝，該工藝存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、淀粉利用率不高等問(wèn)題。相對(duì)于傳統(tǒng)游離發(fā)酵過(guò)程中的不足，固定化酵母因其具備明顯的優(yōu)勢(shì),在燃料乙醇發(fā)酵生產(chǎn)上得到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。固定化酵母發(fā)酵具有底物耐受性強(qiáng)、發(fā)酵周期短以及對(duì)原料轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn)[4]。傳統(tǒng)的固定化方法主要采用凝膠包埋技術(shù)，如卡拉膠、海藻酸鈣、自絮凝技術(shù)以及近年來(lái)流行的新型吸附介質(zhì)秸稈渣等[5]。艾特玲[6]采用脫木素鋸末和海藻酸鈉固定化酵母細(xì)胞，同時(shí)考察固定化酵母細(xì)胞產(chǎn)乙醇的效果；發(fā)酵的結(jié)果表明:最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件下的稻草進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，接種固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵96 h后，乙醇得率為0.370 g/g。郭藝山等[7]以多孔鋼渣、硅藻土和珍珠巖等材料為細(xì)胞宿主載體，采用空化制泡工藝制備成多孔質(zhì)固化載體，并應(yīng)用于糖蜜酒精發(fā)酵中，結(jié)果表明，該載體具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和優(yōu)良的發(fā)酵特性，發(fā)酵酒度達(dá)11%(體積分?jǐn)?shù)) 。目前研究的這些載體雖具有成型方便及固定化密度高等優(yōu)點(diǎn)，但存在固定化成本高、溶液傳質(zhì)效果差及對(duì)物料要求較高(如，不溶性固含物濃度要足夠低)等缺陷，從而限制了在工業(yè)上的應(yīng)用。

針對(duì)目前固定化發(fā)酵過(guò)程中的不足，筆者提出了基于微生物集群效應(yīng)的生物膜催化體系，利用化學(xué)修飾的方法以實(shí)現(xiàn)介質(zhì)表面與微生物細(xì)胞表面功能基團(tuán)的對(duì)接，在此介質(zhì)誘導(dǎo)下，酵母能快速富集并產(chǎn)生大量的生物膜，從而使得酵母乙醇耐受性明顯提高。此吸附介質(zhì)具有成本低、吸附能力高效及力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)。本文中，筆者首先進(jìn)行1 t級(jí)試驗(yàn)的工藝條件優(yōu)化(影響固定化發(fā)酵的主要因素)；其次，對(duì)比游離和固定化工藝的發(fā)酵效果，研究不同淀粉質(zhì)原料和不同初始糖含量對(duì)發(fā)酵的影響，并分析固定化發(fā)酵工藝的可行性,以期達(dá)到開發(fā)新的燃料乙醇生產(chǎn)工藝的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株

釀酒酵母1308，由河南南陽(yáng)天冠集團(tuán)提供。

1.2 培養(yǎng)基及種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、酵母膏10、蛋白胨20、無(wú)水MgSO40.5、(NH4)2SO44、KH2PO41.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木薯與料按一定比例混合拌勻，配好后，調(diào)pH至5.5～6.0；然后按14 U/g的量加入液化酶(奧谷液化酶單位:30 000 U/mL)；86 ℃攪拌水解2 h，降溫至34 ℃保溫。

種子培養(yǎng)及擴(kuò)大培養(yǎng)：菌株經(jīng)麥芽汁(140 g/L)斜面30 ℃活化2 d后，進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)(32 ℃、150 r/min)，再經(jīng)過(guò)100 L種子罐和1 t種子罐擴(kuò)培，32 ℃通入無(wú)菌空氣(流量4 m3/h)培養(yǎng)10～16 h。

細(xì)胞固定：纖維材料先后置于質(zhì)量濃度為10 g/L的丁二酰亞胺水溶液和5 g/L的丙二醛水溶液中，分別常溫浸泡2 h，再將纖維材料置于去離子水中充分漂洗后烘干，并填裝于1 t發(fā)酵罐中；然后將發(fā)酵罐121 ℃滅菌20 min；再將培養(yǎng)好的種子壓入發(fā)酵罐，打開循環(huán)泵(流量1.5 m3/h)，循環(huán)若干時(shí)間至吸附量達(dá)到一定值后停止固定，排出廢液。

發(fā)酵產(chǎn)酒精：將液化好的木薯液化醪壓入發(fā)酵罐，加入0.2 g/L的尿素和MgSO4及200 U/g的糖化酶(神舟糖化酶，單位為10萬(wàn)U/mL)，循環(huán)量為1 m3/h,特定條件下發(fā)酵48 h。發(fā)酵結(jié)束后，排出的發(fā)酵醪稱質(zhì)量。

30 t罐發(fā)酵工藝流程與1 t發(fā)酵罐的發(fā)酵方法類似。

1.3 分析方法

1.3.1 還原糖、總糖及淀粉率的測(cè)定

還原糖測(cè)定采用斐林試劑滴定法：準(zhǔn)確稱取被測(cè)醪液10.0 g，定容至250 mL，混合搖勻，再用潔凈的移液管準(zhǔn)確吸取5.00 mL試樣，放入裝有混合均勻的斐林甲、乙液各5 mL的三角瓶中，再加入蒸餾水25 mL，混勻后用0.25%葡萄糖進(jìn)行滴定，計(jì)算見式(1)。

(1)

式中:A為空白滴定消耗0.25%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的數(shù)值(mL)；B為滴定試樣消耗0.25%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的數(shù)值(mL)。

總糖測(cè)定方法：先量取充分混勻的發(fā)酵液50 mL,注入250 mL三角瓶中，加水40 mL和20%的鹽酸10 mL，置沸水浴中轉(zhuǎn)化1 h，用200 g/L NaOH溶液中和至微酸性，過(guò)濾到250 mL容量瓶?jī)?nèi)，定容至刻度，搖勻；然后參照還原糖的方法進(jìn)行測(cè)定。

淀粉測(cè)定方法：準(zhǔn)確稱取原料3 g，加水90 mL和20%的鹽酸10 mL加熱酸解，然后參照總糖的測(cè)定方法。

1.3.2 酒精度、酸度、細(xì)胞數(shù)、出芽率及死亡率的測(cè)定

酒精度測(cè)定：稱取發(fā)酵醪100 g蒸酒至100 mL,然后用酒精度計(jì)測(cè)量酒度。

酸度測(cè)定：于150 mL三角瓶中注入20 mL蒸餾水，加2滴酚酞，用0.1 mol/L NaOH滴定至微紅色，再吸取1 mL濾液，繼續(xù)用NaOH滴定至再次出現(xiàn)粉紅色，在30 s內(nèi)不褪色為終點(diǎn)，第2次NaOH滴定的毫升數(shù)乘以10為酸度。

細(xì)胞數(shù)、出芽率及死亡率測(cè)定：取2.5 mL發(fā)酵醪，稀釋至100 mL,滴加1 mL次甲基藍(lán),搖勻，靜置1 min后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.3 掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

酵母固定化載體先進(jìn)行真空冷凍干燥，然后利用掃描電鏡(model JSM-6010型，日本JEOL 公司)觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 淀粉利用率和糧耗

淀粉利用率及生產(chǎn)1 t乙醇所需的糧耗計(jì)算分別見式(2)～(3)。

淀粉利用率 =(總出料量×酒精度×0.01×0.789)/(木薯質(zhì)量×淀粉含量×0.567 9)×100%

(2)

標(biāo)準(zhǔn)糧耗 =(木薯質(zhì)量×淀粉含量)/(總出料量×酒精度×0.789×0.01×0.7)

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 小試發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

溫度是燃料乙醇發(fā)酵過(guò)程中重要的工藝參數(shù)，對(duì)酵母細(xì)胞活性和糖化酶活力均有較強(qiáng)的影響[8]。如果溫度過(guò)低，酵母酶活性低，發(fā)酵能力較弱，初始糖化酶酶解速率較低，最終表現(xiàn)為總糖消耗不徹底，殘留總糖濃度較高，從而影響淀粉利用率。為了優(yōu)化固定化發(fā)酵工藝條件,在1 t發(fā)酵罐中，首先考察溫度對(duì)固定化酵母發(fā)酵的影響，結(jié)果見表1。

表1 溫度對(duì)固定化發(fā)酵的影響

由表1可知：發(fā)酵平均初始總糖質(zhì)量濃度235.0 g/L，每個(gè)條件重復(fù)了3～5批(下同，染菌時(shí)除外，另外，因數(shù)據(jù)較多，只給出了各個(gè)條件下的平均值)。當(dāng)溫度較低時(shí)(30 ℃)，反應(yīng)速度較慢，殘留總糖較高。初始溫度調(diào)至34 ℃，殘留總糖明顯升高，酒精度達(dá)到13.7%,淀粉利用率相比低溫提高2.6%，糧耗也降低5.4%；當(dāng)溫度繼續(xù)長(zhǎng)高后，殘留總糖有明顯上升的趨勢(shì)，細(xì)胞密度也有明顯提高，酸度發(fā)生明顯變化，生酸幅度較大，酒精度下降幅度也較大。這與沈飛等[9]在固定化酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁液制取酒精的研究結(jié)果較為一致。在42 ℃時(shí)，淀粉利用率降低至81.0%，糧耗相比34 ℃時(shí)的值更是提高了9.1%。結(jié)果說(shuō)明，溫度過(guò)低和過(guò)高均不利于固定化酵母發(fā)酵。

這是因?yàn)榘l(fā)酵溫度過(guò)高，酵母活性較強(qiáng)，發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)速度過(guò)快，加速酵母老化，尤其溫度上升至42 ℃，發(fā)酵過(guò)程中酵母死亡率較高(15%～25%)，發(fā)酵后期可達(dá)30%左右。同時(shí)，溫度升高加大了染菌風(fēng)險(xiǎn)，表現(xiàn)為雜菌濃度高，生酸幅度大。另外，高溫度加快了初期糖化酶酶解速度，導(dǎo)致初始還原糖濃度高，抑制酵母發(fā)酵能力。

2.1.2 初始pH對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵液的初始pH對(duì)酵母發(fā)酵也具有重要的影響。當(dāng)pH較低時(shí)，可以有效避免發(fā)酵液染菌，但將影響糖化酶酶解效果，使得總糖利用不徹底；另外，低pH會(huì)使胞內(nèi)pH降低,導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝受到嚴(yán)重抑制，降低了總糖的消耗速度[10]；而當(dāng)pH較高時(shí)，雖然有利于菌體生長(zhǎng)，同時(shí)也促進(jìn)雜菌大量繁殖，導(dǎo)致酸度上升，抑制酵母發(fā)酵。因此，考察不同初始pH對(duì)固定化發(fā)酵工藝的影響，結(jié)果見表2。

表2 初始pH對(duì)固定化發(fā)酵的影響

由表2可知：在pH 3.8條件下，發(fā)酵終點(diǎn)的酸度僅為4.5，生酸幅度為1.5，有效抑制了雜菌生長(zhǎng)。淀粉利用率明顯提高。將pH調(diào)至5.0，發(fā)酵終點(diǎn)的酸度和酵母細(xì)胞密度明顯上升，但殘留總糖略有提高，淀粉利用率降低明顯，糧耗變化也較大。當(dāng)pH提高至5.5時(shí)，酸度達(dá)到6.5，達(dá)到染菌的標(biāo)準(zhǔn)，殘留總糖量較高，酵母細(xì)胞密度較低，且酒精度僅有11.9%，高殘?zhí)呛透咚岫戎祵?dǎo)致該條件下的淀粉利用率降至79.3%，糧耗相比最優(yōu)pH條件下的水平，提高了11.1%。因此，該體系的最佳pH為4.4，此環(huán)境下最有利于酵母發(fā)酵，其產(chǎn)量和原料轉(zhuǎn)化率最高，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[11-13]。

2.1.3 循環(huán)量對(duì)發(fā)酵的影響

考察循環(huán)量對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果見表3。由表3可知，將循環(huán)量從1.0 m3/h調(diào)至2.0 m3/h，殘留總糖明顯上升，酒精度高達(dá)13.9%(體積分?jǐn)?shù))，淀粉利用率達(dá)到最高值86.7%，糧耗降至2.89 t。當(dāng)循環(huán)量調(diào)至3.0 m3/h，殘留總糖水平略有下降，細(xì)胞密度較高，酒精度、淀粉利用率及糧耗變化不明顯。由此可見，在一定范圍內(nèi)，循環(huán)量對(duì)固定化酵母發(fā)酵影響較大，主要在于傳質(zhì)效果明顯提高，利于糖化酶對(duì)作用底物的水解和改善，并利于酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。

表3 循環(huán)量對(duì)固定化發(fā)酵的影響

2.2 中試規(guī)模發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 游離酵母發(fā)酵與固定化發(fā)酵對(duì)比

為了評(píng)估固定化酵母應(yīng)用價(jià)值，在最佳的工藝條件下，進(jìn)行了30 t罐放大試驗(yàn)，并在同一發(fā)酵罐中，利用同一物料和同一發(fā)酵溫度，模擬了傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)方式(中糧現(xiàn)有生產(chǎn)工藝：接種量30%，24 h補(bǔ)料至滿罐發(fā)酵)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知：固定化酵母發(fā)酵速度明顯快于游離酵母發(fā)酵。游離酵母水平明顯低于后者，且隨著反應(yīng)批次的變化，固定化體系中游離酵母細(xì)胞密度有降低的趨勢(shì)，并于第3批趨于穩(wěn)定?？偺堑南乃俣入S著批次的增加，也有明顯加快的現(xiàn)象；另外，還原糖在初期時(shí)濃度較高，說(shuō)明載體對(duì)糖化酶有少量吸附的作用，可以加強(qiáng)連續(xù)批次發(fā)酵時(shí)的酶解作用。

進(jìn)一步分析不同發(fā)酵方式對(duì)生產(chǎn)燃料乙醇的影響，結(jié)果見表4。

由表4可明顯看出：在固定化酵母發(fā)酵中，總糖利用較為徹底，酒精度明顯較高，而游離的酵母密度大幅降低，最終的淀粉利用率比游離的高3.5%，糧耗降低了4.2%。相關(guān)研究表明：固定化載體可促進(jìn)菌體形成明顯的生物膜，降低細(xì)胞毒害作用[15-16]，因此，筆者利用掃描電子顯微鏡來(lái)檢查酵母在載體上固定化的情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知：固定化酵母在載體上產(chǎn)生群聚現(xiàn)象，這樣會(huì)發(fā)酵速度加快，這與文獻(xiàn)[15-16]的研究結(jié)果一致。另外，殘留總糖和游離酵母細(xì)胞密度水平明顯降低，表明固定化酵母對(duì)總糖的利用效果較高，從而表現(xiàn)出高淀粉利用率和低糧耗。

圖1 游離酵母發(fā)酵工藝與固定化發(fā)酵效果對(duì)比Fig.1 Comparison of traditional free fermentation process and immobilized fermentation

圖2 固定化酵母發(fā)酵時(shí)載體表面吸附的酵母菌群Fig.2 SEM image of yeast colony adsorbed on carrier surface during immobilized yeast fermentation

表4 發(fā)酵方式效果對(duì)比

注：①這是實(shí)際試生產(chǎn)中的第3批和第4批的平均值。

2.2.2 不同淀粉質(zhì)原料對(duì)發(fā)酵的影響

由于工業(yè)生產(chǎn)原料多樣性，有必要考察不同初始糖和玉米粉原料對(duì)固定化酵母發(fā)酵的影響,結(jié)果見表5。

表5 不同淀粉質(zhì)原料對(duì)固定化發(fā)酵效果對(duì)比

由表5可知：將木薯原料比例提高，發(fā)酵后殘留總糖水平略有提高，淀粉利用率下降1.4%，糧耗略有提高。另外，改用玉米原料后，殘留總糖濃度較高，主要由于酶解不徹底。細(xì)胞密度升高，可能源自玉米淀粉中較為豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)。酒精度與木薯發(fā)酵條件下的水平相當(dāng)，淀粉利用率略低于木薯發(fā)酵乙醇的值，糧耗提高不明顯。由此可知，當(dāng)總糖質(zhì)量濃度在260.0 g/L以下，固定化酵母發(fā)酵不受明顯影響，在高濃度初始糖發(fā)酵條件下，酒精度達(dá)15.3%，說(shuō)明固定化酵母可實(shí)現(xiàn)高濃度乙醇發(fā)酵，這可降低后期蒸酒能耗。另外，原料來(lái)源不同，對(duì)固定化酵母發(fā)酵影響不大，說(shuō)明基于微生物集群效應(yīng)的固定化酵母發(fā)酵體系具有較強(qiáng)的應(yīng)用性。

3 結(jié)論

1) 1 t級(jí)試驗(yàn)結(jié)果表明：在最優(yōu)的條件(溫度34 ℃、初始pH 4.4、循環(huán)量為2.0 m3/h)下發(fā)酵，淀粉利用率可達(dá)86.7%，1 t乙醇的糧耗為2.89 t。

2) 在30 t中試規(guī)模水平上，對(duì)比了固定化發(fā)酵與游離細(xì)胞發(fā)酵的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明：固定化酵母發(fā)酵總糖消耗更徹底，游離細(xì)胞水平更低，最終淀粉轉(zhuǎn)化率比游離酵母發(fā)酵提高了3.5%，糧耗降低了4.2%。

3) 在高濃度糖條件下，固定化酵母發(fā)酵酒精度可達(dá)15.3%(體積分?jǐn)?shù)),實(shí)現(xiàn)了高濃度酒精發(fā)酵；另外，利用玉米原料，同樣可以達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定發(fā)酵的效果，滿足工業(yè)原料多元化的生產(chǎn)。

本研究結(jié)果表明，利用微生物集群效應(yīng)的發(fā)酵體系具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHU S,WU Y,YU Z,et al.Simultaneous saccharification and fermentation of microwave/alkali pre-treated rice straw to ethanol[J].Biosyst Eng,2005,92(2):229-235.

[2] BAEYENS J,KANG Q,APPELS L,et al.Challenges and opportunities in improving the production of bio-ethanol[J].Prog Energy Combust Sci,2015,47:60-88.

[3] NGUYEN T H,WILLIAMS S,PAUSTIAN K.Impact of ecosystem carbon stock change on greenhouse gas emissions and carbon payback periods of cassava-based ethanol in Vietnam[J].Biomass Bioenergy,2017,100:126-137.

[4] 劉帥,孫培玉,曲洋，等.包埋法固定化微生物技術(shù)中的載體選擇及在污水生物處理中的應(yīng)用[J].河南科學(xué),2009,27(5):554-558.

[5] 張強(qiáng),嵇冶.固定化細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于酒精發(fā)酵中的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2017,36(4):1404-1409.

[6] 艾特玲.基于游離和固定化細(xì)胞技術(shù)制備生物乙醇的基礎(chǔ)研究[D].南京:東南大學(xué),2015.

[7] 郭藝山,尚紅巖,黃向陽(yáng),等.一種多孔質(zhì)固定化酵母在糖蜜酒精生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J].廣西糖業(yè),2016(4):20-23.

[8] SZYMANOWSKA D,GRAJEK W.Simultaneous saccharification and ethanol fermentation of granular corn starch with recycling of liquid fraction of stillage in an agro-distillery plant[J].Acta Sci Pol:Biotechnol,2009,8(3):25-46.

[9] 沈飛,劉榮厚.固定化酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁工藝參數(shù)對(duì)酒精得率的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2007,23 (10):186-191.

[10] 劉興艷.低pH對(duì)釀酒酵母酒精發(fā)酵的影響及酵母應(yīng)答酸脅迫機(jī)制初探[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[11] 董成漢,舒代建，余永平.pH值對(duì)發(fā)酵酒精度和出酒率影響的研究:正交試驗(yàn)法在酒精生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].釀酒科技,1989(1):16-17.

[12] 金慧,劉榮厚.pH值對(duì)固定化酵母甜高粱莖稈汁液酒精發(fā)酵的影響[J].農(nóng)機(jī)化研究,2007(10):106-108.

[13] 覃趙軍,賴鈞灼,劉斌,等.不同初始pH值的乙醇發(fā)酵過(guò)程拉曼光譜分析[J].中國(guó)激光,2013,40(2):229-235.

[14] 馮學(xué)愚.強(qiáng)制循環(huán)發(fā)酵液的酒精發(fā)酵研究[J].四川理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自科版),1994(3):7-10.

[15] LIU Q,CHENG H,WU J,et al.Long-term production of fuel ethanol by immobilized yeast in repeated-batch simultaneous saccharification and fermentation of cassava[J].Energy Fuel,2015,29(1):185-190.

[16] LEE K H,CHOI I S,KIM Y G,et al.Enhanced production of bioethanol and ultrastructural characteristics of reusedSaccharomycescerevisiaeimmobilized calcium alginate beads[J].Bioresour Technol,2011,102(17):8191-8198.