Desulfovibrio desulfuricans G20生理特性及處理含鉻(Ⅵ)硫酸鹽廢水的研究

李 想，張雪英，王 婷，沈蔚然，姜 添，周 俊

(1.南京工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 211800； 2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria，SRB)是一類以有機(jī)物為電子供體，以硫酸鹽、亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽等以及元素硫?yàn)殡娮邮荏w，通過異化作用將其還原為硫化物的細(xì)菌[1]。SRB廣泛存在于自然界，在海水、土壤、生活生產(chǎn)、工業(yè)廢水、海水及河水底泥中均有分布，由于SRB普遍存在于厭氧環(huán)境中，它們在硫和碳循環(huán)中起重要作用。但是，SRB會對海洋石油等工業(yè)造成嚴(yán)重影響，因?yàn)榇x過程中產(chǎn)生硫化物，具有高度反應(yīng)性、腐蝕性和毒性。由此可見，SRB可以去除廢水中的硫酸鹽及重金屬，在一定程度上可以修復(fù)環(huán)境。盡管對于SRB的研究已經(jīng)超過一個(gè)世紀(jì)，但是隨著分子生物學(xué)和基因組技術(shù)的不斷進(jìn)步，對SRB的生活方式的詳細(xì)解析成為可能[2]。SRB的代謝過程可以簡單地分為分解階段、電子傳遞階段和氧化階段這3個(gè)階段[3]。圖1表明描述這一過程的分解代謝、電子傳遞和SRB的關(guān)系。

圖1 SRB 的分解代謝過程Fig.1 Metabolic degrading process of SRB

筆者前期通過從南京某污水處理廠濃縮污泥中馴化混合硫酸鹽還原菌，探究其對硫酸鹽廢水的處理效果[11]，在本文中，完全模擬此污水處理廠廢水性質(zhì)，選取一株純種硫酸鹽還原菌D.desulfuricansG20為研究對象，考察其在不同條件下的生長狀況，再研究它對Cr6+的耐受濃度及處理含鉻(Ⅵ)硫酸鹽廢水的效果，為將來D.desulfuricansG20的工業(yè)應(yīng)用建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

D.desulfuricansG20菌株由中國科學(xué)院成都生物研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

D.desulfuricansG20采用培養(yǎng)基為Postgate C[12]，其成分為KH2PO40.5 g/L、NH4Cl 1.0 g/L、CaCl2·2H2O 0.06 g/L、Na2SO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、酵母膏1.0 g/L、檸檬酸鈉0.3 g/L、60%乳酸鈉6 mL/L。

還原劑：配制0.25 g/L L-半胱氨酸溶液，用N2吹5 min，加蓋密封，滅菌，冷卻。培養(yǎng)基中加入1%的上述半胱氨酸溶液(注：一般用100 mL厭氧瓶配制50 mL，4 ℃下保存)。

氧氣指示劑：配制1%刃天青水溶液。

1.2 D.desulfuricans G20的富集培養(yǎng)

在潔凈工作臺中，用無菌注射器按照10%的接種量將D.desulfuricansG20注入上述制作好的培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37 ℃、100 r/min的條件下進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)。待菌液由澄清透明變?yōu)闇啙?，即表明此富集的D.desulfuricansG20濃度較高。

1.3 D.desulfuricans G20的生長曲線

采用18 mm×150 mm的玻璃厭氧管，分裝Postgate C培養(yǎng)基4.45 mL，加入0.05 mL 0.25 g/L L-半胱氨酸溶液，充入N2，密封，滅菌。在潔凈工作臺上接種0.5 mL的菌液，置于37 ℃、100 r/min的搖床中，振蕩培養(yǎng)20 h。不定時(shí)用紫外-可見分光光度計(jì)以培養(yǎng)基為參比，測定菌體生長情況，通過OD600測量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度。每組做3個(gè)平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.4 菌株生理生化性質(zhì)

1.4.1 溫度對菌體生長的影響

設(shè)定22、27、32、37、42和47 ℃的溫度梯度培養(yǎng)20 h，通過OD600測量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度。

1.4.2 pH對菌體生長的影響

設(shè)定pH為4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2和10.2的梯度，通過OD600測算細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度。

1.4.3 碳源對菌體生長的影響

以甲酸、乙酸、甲醇、乙醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖、乳酸鈉和乙酸鈉為碳源培養(yǎng)D.desulfuricansG20，不定時(shí)通過 OD600測量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度。

1.4.4 硫源對菌體生長的影響

以硫、MgSO4、Na2SO4、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉為硫源培養(yǎng)D.desulfuricansG20，不定時(shí)通過 OD600測量細(xì)菌培養(yǎng)液的濃度。

1.5 D.desulfuricans G20對含Cr6+的硫酸鹽廢水的研究

1.5.1D.desulfuricansG20對Cr6+的耐受度

玻璃厭氧管分裝Postgate C培養(yǎng)基后分別加入K2Cr2O7無菌溶液，使之與培養(yǎng)基混合后的Cr6+質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150、175和200 mg/L。每隔12 h觀察菌體生長狀況，觀察持續(xù)3 d。同時(shí)，每隔4 h測定試驗(yàn)中菌液生長OD600值，持續(xù)測定24 h。

1.5.2D.desulfuricansG20處理不同濃度含Cr6+廢水的效果

2 結(jié)果與討論

2.1 D.desulfuricans G20的生長曲線

通過對D.desulfuricansG20進(jìn)行40 h的監(jiān)測，不定期測量其OD600，繪制該菌生長曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，D.desulfuricansG20菌株在前2 h處于生長延滯期，2～18 h 菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，18～26.5 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，期間菌密度 OD600達(dá)到最大值(0.697)，26.5 h后開始進(jìn)入衰亡期。為保證菌株活躍度及均量一致，一般接種18～26.5 h的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。

圖2 D.desulfuricans G20在postgate C培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of D.desulfuricans G20 in postgate C medium

2.2 菌株生理生化性質(zhì)

2.2.1 溫度對D.desulfuricansG20生長的影響

圖3 不同溫度下D.desulfuricans G20生長量Fig.3 Biomass of D.desulfuricans G20 at different temperatures

溫度的變化會影響微生物的生長、代謝和繁殖。適宜的溫度能刺激微生物的生長；當(dāng)溫度過高時(shí)，微生物的蛋白質(zhì)和核酸會變性失活；當(dāng)溫度過低時(shí)，會抑制酶活性，減弱細(xì)胞新陳代謝[13]。設(shè)置溫度梯度為22、27、32、37、42和47 ℃，考察溫度對D.desulfuricansG20的生長的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，D.desulfuricansG20菌株在不同的溫度條件下，生長狀況不同。在32～42 ℃時(shí)，D.desulfuricansG20均生長良好，最佳生長溫度為37 ℃，培養(yǎng)17 h時(shí)生長量達(dá)到最高OD600(0.741)。在14 h內(nèi)，42 ℃下菌株生長速度高于32 ℃，之后32 ℃下菌株生長速度高于42 ℃的菌株生長速度，其在20 h時(shí)分別達(dá)到最高OD600，32 ℃為0.740，42 ℃為0.581。22、27 ℃時(shí)可生長，但生長緩慢。47 ℃時(shí)菌株基本不生長。廢水研究的純種菌體系中，硫酸鹽還原菌的最佳生長溫度大多在30 ℃左右，但混合菌群體系的實(shí)際應(yīng)用中，硫酸鹽還原菌的生長速度還取決于菌群中的競爭因素[14]。

2.2.2 初始pH對D.desulfuricansG20生長的影響

設(shè)置不同初始pH分別為4.2、5.2、6.2、7.2、8.2、9.2和10.2，考察其對D.desulfuricansG20生長的影響，如圖4所示。由圖4可以看出，在初始pH為6.2～9.2時(shí)，菌株生長狀況良好。硫酸鹽還原菌可容忍的pH最大范圍在4.0～9.5[15]。當(dāng)pH超出菌株忍受濃度，會通過降低SRB酶活性抑制菌株生長和代謝[16]。菌株在初始pH值為8.2時(shí)，生長速度最快，10 h進(jìn)入穩(wěn)定期，最高OD600值達(dá)到0.661。隨著初始pH的升高，菌株生長速度呈現(xiàn)下降趨勢。在初始pH為7.2和9.2時(shí)，菌株的生長量及生長速度差不多。當(dāng)初始pH達(dá)到10.2時(shí)，菌株生長速度明顯減慢，20 h時(shí)達(dá)到最高OD600，為0.333。初始pH為6.2時(shí)，生長速度比初始pH為7.2時(shí)稍慢，到20 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，并達(dá)到最高OD600，為0.627。但是在初始pH下降到5.2及以下時(shí)，菌株基本不生長。因此，可認(rèn)為D.desulfuricansG20生長的最佳初始pH為8.2。當(dāng)初始pH偏酸性時(shí)，體系中較多的游離硫化氫含量會對D.desulfuricansG20生長產(chǎn)生抑制作用；當(dāng)pH偏堿性時(shí),體系中主要是以HS-狀態(tài)存在的硫化物，這些硫化物會和菌體細(xì)胞中的鐵物質(zhì)結(jié)合，從而使得電子傳遞失活[17]。因此，初始pH通過影響游離H2S在體系中的比重影響菌株的生長活性。

圖5 D.desulfuricans G20利用不同碳源在不同時(shí)間的生長量Fig.5 Biomass of D.desulfuricans G20 at different carbon source and time

圖4 不同初始pH下D.desulfuricans G20的生長量Fig.4 Biomass of D.desulfuricans G20 at different pH

2.2.3D.desulfuricansG20對不同碳源的利用

目前，有動物糞便、木屑、肥料和一些其他農(nóng)林廢棄物等天然有機(jī)物和合成有機(jī)物如乙酸、丙酸、丁酸以及乳酸鈉等，可作為碳源以供硫酸鹽還原菌生長繁殖[18]。在富集培養(yǎng)基中，豐富且適宜的碳源可以給菌體提供氮源、維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)菌體生長。本文中，筆者選取甲酸、乙酸、甲醇、乙醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖、乳酸鈉和乙酸鈉作為碳源，考察D.desulfuricansG20對其的利用情況。圖5為D.desulfuricansG20對不同碳源的利用及其24、36 h的生長量。由圖5可以看出，D.desulfuricansG20對不同碳源的利用情況不同。當(dāng)碳源為乳酸鈉、蔗糖和乳糖時(shí)，菌株生長較快，菌液密度較高，其中，碳源為乳酸鈉時(shí)菌株生長最快，其次是葡萄糖及蔗糖，利用蔗糖的菌株后期生長比葡萄糖快。在24 h時(shí)，利用乳酸鈉的菌株OD600最高，達(dá)到0.698，其次是蔗糖和葡萄糖，分別為0.576和0.520。在36 h時(shí)，利用蔗糖的菌株的生長量OD600超過其他碳源，達(dá)到0.742。還可看出，D.desulfuricansG20均可利用以上碳源，利用甲酸、乙醇及乙酸鈉較慢。由此可得出，D.desulfuricansG20的最佳生長碳源為乳酸鈉及蔗糖。

2.2.4D.desulfuricansG20對不同硫源的利用

考察D.desulfuricansG20對硫、MgSO4、Na2SO4、亞硫酸鈉和硫代硫酸鈉等的利用情況，結(jié)果見圖6。由圖6可以看出：D.desulfuricansG20以亞硫酸鈉為硫源時(shí)，菌株生長速度最快，10.5 h時(shí)菌株生長量達(dá)到最高(0.637)。而在硫酸鎂、硫酸鈉和硫代硫酸鈉的培養(yǎng)基中，生長狀況差不多。在以硫單質(zhì)為硫源的培養(yǎng)基中，菌株不生長，說明D.desulfuricans不能利用硫單質(zhì)作為碳源，此現(xiàn)象與馬忠友等[19]研究結(jié)果相似。因此可見，D.desulfuricansG20最適硫源為亞硫酸鈉。

圖6 D.desulfuricans G20利用不同硫源在不同時(shí)間的生長量Fig.6 Biomass of D.desulfuricans G20 at different sulfur sources

2.3 D.desulfuricans G20對含Cr6+的硫酸鹽廢水的研究

2.3.1D.desulfuricansG20對Cr6+的耐受度的研究

硫酸鹽還原菌對Cr6+有去除作用，但當(dāng)Cr6+濃度過高會對硫酸鹽還原菌產(chǎn)生毒害作用[20]。當(dāng)過高濃度的Cr6+進(jìn)入硫酸鹽還原菌細(xì)胞體內(nèi)，會與大分子結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[21]，從而對硫酸鹽還原菌有較強(qiáng)的毒性[22]。因此，研究硫酸鹽還原菌對Cr6+的耐受度對于研究硫酸鹽還原菌處理含Cr6+的硫酸鹽廢水具有重要的意義。筆者研究D.desulfuricansG20在含Cr6+體系中為期3 d的生長狀況，結(jié)果見表1。由表1可知，D.desulfuricansG20能在Cr6+質(zhì)量濃度低于150 mg/L的條件下生長。Cr6+對菌體的毒害作用會隨著Cr6+濃度的增加而加劇，導(dǎo)致菌體生長代謝緩慢，影響硫酸鹽還原菌對Cr6+的脫除[23]。

表1 D.desulfuricans G20在含Cr6+體系中的生長狀況

注：+表示生長，-表示未生長。

圖7 不同Cr6+濃度的條件下的含量的變化Fig.7 Variations of sulfate content at different Cr6+ content

2.3.3 在不同濃度的Cr6+體系中Cr6+的脫除效果

硫酸鹽還原菌對Cr6+的去除有2種方式：吸附作用和生物轉(zhuǎn)化[24]。吸附作用是SRB吸附富集Cr6+以降低環(huán)境中Cr6+的濃度[25]，此過程一般較快，持續(xù)5～10 min。生物轉(zhuǎn)化是SRB通過生長代謝將高毒性的Cr6+還原為低毒性的Cr3+[26]，整個(gè)過程與菌株的生長周期和Cr6+的耐受度有關(guān)。近幾年，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一些微生物通過這兩種方式去除環(huán)境中Cr6+[25,27-30]。不同Cr6+濃度的條件下，各體系中Cr6+濃度隨時(shí)間的變化結(jié)果見圖8。由圖8可知，反應(yīng)剛開始時(shí)，體系中Cr6+的脫除率均達(dá)到80%以上，分別為92.87%、89.9%和83.56%。這是由于培養(yǎng)基及菌體對Cr6+具有吸附作用。隨后，反應(yīng)體系中Cr6+濃度降低可能是由于反應(yīng)體系中的S2-與Cr6+的反應(yīng)[31]。S2-還原Cr6+為Cr3+，而Cr3+又會與OH-發(fā)生反應(yīng)生成Cr(OH)3沉淀，從而對Cr6+有一定的脫除率。從圖8中還可看出，1 h后，在初始Cr6+質(zhì)量濃度為50和90 mg/L的體系中，Cr6+基本被全部去除。而此時(shí)初始Cr6+質(zhì)量濃度為120 mg/L的體系中，Cr6+的去除率為90.24%。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Cr6+的濃度繼續(xù)降低，到18.5 h時(shí)，體系中Cr6+去除率接近100%。這說明，D.desulfuricansG20對Cr6+有著良好的脫除效果。Laxman等[32]和Thacker等[33]都發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對Cr6+的脫除能力會隨著Cr6+初始濃度的升高而降低。

圖8 不同Cr6+濃度的條件下Cr6+含量及脫除率的變化Fig.8 Variations of Cr6+ content and removal rate at different Cr6+ content

3 結(jié)論

D.desulfuricansG20菌株用10%的接菌量在37 ℃下培養(yǎng)前2 h處于生長延滯期，2～18 h 菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，18～26.5 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，26.5 h后開始進(jìn)入衰亡期。

D.desulfuricansG20菌株適宜的生長溫度在32～42 ℃，最適宜溫度為37 ℃；適宜初始pH為6.2～9.2，最佳初始pH為8.2，在初始pH為4.2及5.2時(shí)，菌株基本不生長；最佳生長碳源為乳酸鈉和蔗糖。D.desulfuricansG20不能利用硫單質(zhì)，最適硫源為亞硫酸鈉。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳慶慶,邱賢華,熊貞晟,等.硫酸鹽還原菌處理含硫酸鹽有機(jī)廢水的原理及其應(yīng)用[J].安全與環(huán)境工程,2015,22 (1):90-96.

[2] MUYZER G,STAMS AJ M.The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria[J].Nat Rev Microb,2008,6 (6):441-454.

[3] ANANDKUMAR B,GEORGE R P,MARUTHAMUTHUS,et al.Corrosion behavior of SRBDesulfobulbuspropionicusisolated from an Indian petroleum refinery on mild steel[J].Mater Corros,2012,63 (4):355-362.

[4] 張子棟.六價(jià)鉻毒性作用及其影響因素[J].生物技術(shù)世界,2013(8):71.

[5] 閆旭,李亞峰.含鉻廢水的處理方法[J].遼寧化工,2010,39(2):143-146.

[6] 任軍俊,肖利萍.硫酸鹽還原菌處理廢水的研究進(jìn)展與展望[J].水資源與水工程學(xué)報(bào),2009,20(2):52-56.

[7] 安文輝,馬斯然,王磊峰.硫酸鹽還原菌處理含鉻廢水的研究現(xiàn)狀[J].廣東化工,2012,17(39):97-98.

[8] 賀氣志,陳輝,王丹,等.混合硫酸鹽還原菌與Cu/Fe顆粒協(xié)同處理含鉻廢水的研究[J].環(huán)境科學(xué),2011,32(7):2000-2005.

[9] 陳煒婷,張鴻郭,羅定貴,等.硫酸鹽還原菌處理含重金屬酸性廢水的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,42(31):12422-12424.

[10] 李猛,張鴻郭,周子倩,等.固定化SRB處理低濃度含鉻廢水[J].環(huán)境工程,2016(4):20-24.

[11] 王婷,周俊,徐為中,等.生長因子對SRB處理硫酸鹽廢水的影響研究[J].工業(yè)水處理,2016,36(6):38-42.

[12] 任南琪，王愛杰，趙陽國.廢水厭氧處理硫酸鹽還原菌生態(tài)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2009.

[13] 胡永娟,李學(xué)梅,王海磊,等.抗鉻菌株的篩選鑒定及其生物學(xué)特性和吸附特性[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2014,8(6):2585-2591.

[14] 梁宇.硫酸鹽還原菌的生長因子的探討[J].山西建筑,2010(30):199-200.

[15] 王輝,戴友芝,劉川,等.混合硫酸鹽還原菌代謝過程的影響因素[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2012,6(6):1795-800.

[16] 陳煒婷,張鴻郭,陳永亨,等.pH、溫度及初始鉈濃度對硫酸鹽還原菌脫鉈的影響[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2014,10(8):4105-4109.

[17] 許雅玲,伍健東.pH值對硫酸鹽還原菌顆粒污泥性能的影響[J].工業(yè)用水與廢水,2010,4(1):32-35.

[19] 馬忠友,鄧盾,汪建飛,等.一組混合菌群還原硫酸鹽的特性[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(8):184-188.

[20] 肖利萍,張鐳,李月.硫酸鹽還原菌及其在廢水厭氧治理中的應(yīng)用[J].水資源與水工程學(xué)報(bào),2011,22(1):45-48.

[21] 鄭家傳,張建榮,劉希雯,等.污染場地六價(jià)鉻的還原和微生物穩(wěn)定化研究[J].環(huán)境科學(xué),2014,35(10):3882-3887.

[22] 徐蓮,孫紀(jì)全,吳曉磊,等.菌株Rhodococcussp.Chr-9和Exiguobacteriumsp.Chr-43的除鉻(VI)特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2012,18(6):971-977.

[23] 秦利玲,王天貴.用細(xì)菌解毒水溶液中六價(jià)鉻的實(shí)驗(yàn)研究[J].化學(xué)工程師,2010(10):37-41.

[24] 王謙,李延,孫平,等.含鉻廢水處理技術(shù)及研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2013,36(12):150-156.

[25] 張瑩,章瑩穎,唐杰,等.微小桿菌Exiguobacteriumsp.MH3對六價(jià)鉻的還原特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2014,20(5):791-797.

[26] KANMANI P,ARAVIND J,PRESTON D.Remediation of chromium contaminants using bacteria[J].Int J Environ Sci Technol,2011,9 (1):183-193.

[27] SARANGI A,KRISHNAN C.Comparison of in vitro Cr(VI) reduction by CFEs of chromate resistant bacteria isolated from chromate contaminated soil[J].Bioresour Technol,2008,99(10):4130-4137.

[28] FERRO OROZCO A M,CONTRERAS E M,ZARITZKY N E.Cr(VI) reduction capacity of activated sludge as affected by nitrogen and carbon sources,microbial acclimation and cell multiplication[J].J Hazard Mat,2010,176(1/2/3):657-665.

[29] ALAM M Z,MALIK A.Chromate resistance,transport and bioreduction byExiguobacteriumsp.ZM-2 isolated from agricultural soil irrigated with tannery effluent[J].J Basic Microbiol,2008,48(5):416-420.

[30] ALAM M Z,AHMAD S.Chromium removal through biosorption and bioaccumulation by bacteria from tannery effluents contaminated soil[J].CLEAN - Soil,Air,Water,2011,39(3):226-237.

[31] 李福德,李昕,謝翼飛,等.微生物去除重金屬和砷:復(fù)合硫酸鹽還原菌法的機(jī)理與技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011.

[32] LAXMAN R S,MORE S.Reduction of hexavalent chromium byStreptomycesgriseus[J].Minerals Eng,2002,15(11):831-837.

[33] THACKER U,PARIKH R,SHOUCHE Y,et al.Reduction of chromate by cell-free extract ofBrucellasp. isolated from Cr (VI) contaminated sites[J].Bioresour Technol,2007,98(8):1541-1547.