漆大姑水提物外用對慢性皮炎-濕疹模型小鼠的改善作用研究Δ

阮毅銘，梅全喜，關(guān)健纓，王書芹，伍軍軍，陳劍波，曹崇波（1.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山市中醫(yī)院藥學部，廣東中山 2800；2.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山市中醫(yī)院科教科，廣東中山 2800；.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山市中醫(yī)院皮膚科，廣東中山 2800；.廣州中醫(yī)藥大學附屬中山市中醫(yī)院病理科，廣東中山 2800；.廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣州 10006）

慢性皮炎-濕疹是臨床常見的一種遲發(fā)型超敏反應性皮膚病[1]，目前主要是采用局部治療加全身抗過敏治療。其中，局部治療主要以皮膚外用糖皮質(zhì)激素類藥物為主；全身治療主要使用H1受體拮抗藥，嚴重者使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑。但這些藥物均存在作用環(huán)節(jié)單一、不良反應較大、易復發(fā)等問題，如糖皮質(zhì)激素類可以抑制遲發(fā)型超敏反應，是當前治療慢性皮炎-濕疹的最常用藥物，臨床上也取得了明顯的效果，但無論是局部外用還是全身用藥，若長期使用均表現(xiàn)出明顯的副作用[2-4]。此外，長時間應用還會導致快速減敏或耐受現(xiàn)象[5]，而目前使用的抗組胺藥（H1受體拮抗藥）均為抗Ⅰ型變態(tài)反應的藥物，但本病是遲發(fā)型超敏反應，抗組胺藥也只能起到暫時緩解瘙癢的作用，并不能改善局部炎癥浸潤，故抗組胺藥在臨床應用上受到了極大的限制。相比之下，中醫(yī)藥對慢性皮炎-濕疹的治療獨具優(yōu)勢，能通過多靶點、多種途徑發(fā)揮作用。

漆大姑為大戟科植物毛果算盤子的枝葉，又名毛漆、漆大伯、毛果算盤子等，具有驅(qū)風利濕、止血、散瘀、消腫的功效，分布于福建、廣東、海南、廣西等地，南方部分地區(qū)民間將其用于治療生漆過敏、稻田皮炎、皮膚瘙癢、蕁麻疹和濕疹等病癥，用藥方式為鮮用或干葉煎水外洗[6-7]?！渡讲菟幹改稀酚涊d：“凡患漆瘡皮膚紅腫作癢，取其葉煎水洗一、二次即愈”[8]。以上報道提示漆大姑有治療過敏性皮膚病的功用，但都是經(jīng)驗用藥未進行藥理研究，國內(nèi)外亦未見漆大姑外用治療慢性皮炎-濕疹的藥效學相關(guān)研究。本課題組前期的藥理研究已證實，漆大姑具有抗皮膚遲發(fā)型超敏反應的作用[9]，而皮炎-濕疹的發(fā)病原因就是皮膚的一種遲發(fā)型超敏反應。因此，本研究自制漆大姑水提物，通過研究其對慢性皮炎-濕疹模型小鼠的改善作用，為進一步利用漆大姑開發(fā)一種安全、有效、副作用小的皮膚科新藥提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；游標卡尺（哈爾濱量具刃具集團有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪高科儀器廠）；DSX100光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

漆大姑枝葉于2016年9月份采自廣東省中山市五桂山，樣品經(jīng)中山市中醫(yī)院曾聰彥主任中藥師鑒定為真品；復方醋酸曲安奈德溶液（廣東恒誠制藥有限公司，批號：1608407，規(guī)格：0.001 g/mL）；2，4-二硝基氯苯（DNCB，美國Sigma公司，批號：STBF4847V，純度：99%）；丙酮（天津市富宇精細化工有限公司，批號：20160626，純度：99.9%）；1，2-丙二醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號：20161012，分析純）；橄欖油（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160912，分析純）。

1.3 動物

SPF級KM小鼠60只，18～22 g，♀♂各半，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2013-0034。實驗過程中，小鼠自由攝水和攝食，環(huán)境溫度控制在20～22℃，濕度控制在55%～60%，正常光照。

2 方法

2.1 漆大姑水提物的制備

取漆大姑干燥枝葉1 000 g，粉碎成粗粉，加入10倍量的蒸餾水浸泡60 min后煎煮，沸后用文火煮60 min，濾出煎液；濾渣加8倍量水，沸后再用文火煮60 min，濾出煎液。合并2次濾液，4℃貯藏24 h后抽濾，在70℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮濾液至450 mL（提取率為31.6%），4℃貯藏。臨用前，分別加入蒸餾水和體積分數(shù)為7.0%的藥用1，2-丙二醇（作透皮促進劑），制備成高、中、低濃度（分別含漆大姑生藥2.0、1.0、0.5 g/mL）的藥液（給藥劑量根據(jù)前期預實驗結(jié)果和文獻[9]確定）。

2.2 造模

于實驗前1天，用剃毛剪對KM小鼠進行腹部脫毛，裸露皮膚面積約3 cm×2 cm。正式實驗當天（d0），用微量移液器移取6%DNCB-丙酮橄欖油溶液100 μL，均勻涂抹于小鼠裸露皮膚處致敏，次日再加強致敏1次，5 d后在小鼠右耳正、反兩側(cè)均勻涂抹1%DNCB-丙酮橄欖油溶液各10 μL激發(fā)，同時在左耳涂等量的丙酮橄欖油溶液作對照，每隔3天激發(fā)1次，共激發(fā)3次[10-11]。

2.3 分組與給藥

將60只小鼠按體質(zhì)量和性別隨機分為6組，每組10只，分別為空白組（蒸餾水）、模型組（蒸餾水）、復方醋酸曲安奈德溶液組（陽性對照，原液）和漆大姑水提物高、中、低濃度組。除空白組外，其余5組小鼠均按“2.2”項下方法造模。于實驗第3天開始給藥，均外涂于小鼠右耳正、反兩面，每次用量共計15 μL（給藥劑量是根據(jù)前期的預實驗確定），每天7：00和15：00各給藥1次，連續(xù)給藥12 d（若于激發(fā)當日，則在激發(fā)前2 h給藥）。

2.4 漆大姑水提物對模型小鼠右耳厚度差的影響

先用游標卡尺根據(jù)單盲法測量致敏前（d0）以及實驗第9、12、15天每次激發(fā)24 h后（d10、d13、d16）小鼠右耳中部厚度，計算每次激發(fā)后與致敏前的右耳厚度差，以觀察漆大姑枝葉水提物對模型小鼠耳組織炎癥腫脹的改善情況。

2.5 漆大姑水提物對模型小鼠耳部搔抓次數(shù)的影響

先記錄致敏前30 min內(nèi)小鼠對耳部的搔抓次數(shù)，小鼠后爪對耳部搔或抓1下，每個動作記1次，連續(xù)抓或搔幾下就記幾次；前肢的活動以及后爪對面、耳部附近、腹部等處的搔抓則不作統(tǒng)計。以“2.4”項下小鼠右耳厚度差測定的時間為節(jié)點，順延30 min觀察小鼠由于右耳慢性皮炎-濕疹引發(fā)瘙癢導致抓搔耳部的情況，記錄30 min內(nèi)小鼠對耳部的搔抓次數(shù)。

2.6 漆大姑水提物對模型小鼠耳腫脹度的影響

末次激發(fā)后24 h，搔抓動作觀察完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，拭凈小鼠耳殘留藥物，肉眼觀察耳大體情況后沿耳廓基線剪下完整雙耳，用直徑0.8 cm的金屬打孔器在左、右耳中部的同一位置打孔取圓形耳片，立即用電子分析天平精確稱量耳片質(zhì)量，并計算耳腫脹度[耳腫脹度（mg）＝右耳片質(zhì)量（mg）－左耳片質(zhì)量（mg）]及腫脹抑制率[耳腫脹抑制率（%）＝（模型組耳腫脹度－給藥組耳腫脹度）/模型組耳腫脹度×100%]。

2.7 漆大姑水提物對模型小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

處死小鼠，分離小鼠胸腺和脾組織，稱質(zhì)量，計算胸腺（脾）指數(shù)[胸腺（脾）指數(shù)＝胸腺（脾）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×10]。

2.8 漆大姑水提物對模型小鼠耳組織病理學的影響

分別將各組小鼠切下的右耳片放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定，浸蠟，包埋，常規(guī)制成5μm的石蠟切片。切片行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學顯微鏡下觀察耳組織病理學變化。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析。結(jié)果以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dennett’s檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠激發(fā)后與致敏前右耳厚度差測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠激發(fā)后右耳厚度差均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，復方醋酸曲安奈德溶液組和漆大姑水提物各濃度組小鼠的右耳厚度差均不同程度地減小，除漆大姑水提物低濃度組小鼠在實驗第16天的右耳厚度差減小不明顯外，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠右耳厚度差測定結(jié)果（±s，n＝10，mm）Tab 1 Difference of right ear thickness in mice in each group（±s，n＝10，mm）

表1 各組小鼠右耳厚度差測定結(jié)果（±s，n＝10，mm）Tab 1 Difference of right ear thickness in mice in each group（±s，n＝10，mm）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組復方醋酸曲安奈德溶液組漆大姑水提物高濃度組漆大姑水提物中濃度組漆大姑水提物低濃度組d16－d0 0.020±0.002 0.181±0.012＊＊0.121±0.013##0.143±0.019##0.166±0.017#0.174±0.019 d0 0.160±0.003 0.161±0.004 0.162±0.003 0.159±0.003 0.162±0.002 0.161±0.004右耳厚度差，mm d10－d0 0.018±0.004 0.075±0.007＊＊0.044±0.007##0.049±0.005##0.053±0.008##0.066±0.006##d13－d0 0.018±0.002 0.128±0.004＊＊0.073±0.013##0.090±0.009##0.097±0.011##0.119±0.010#

3.2 小鼠30 min內(nèi)耳部搔抓次數(shù)測定結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠耳部涂抹1%DNCB-丙酮溶液激發(fā)后，小鼠由于瘙癢出現(xiàn)明顯搔抓患耳現(xiàn)象，并在24 h內(nèi)達到最高峰，隨后緩慢下降；隨著再次激發(fā)和激發(fā)次數(shù)的增加，搔抓次數(shù)明顯增加（P＜0.01），表明瘙癢模型適用。與模型組比較，漆大姑水提物高、中濃度組小鼠在d10、d13、d16時對耳部的搔抓次數(shù)以及漆大姑水提物低濃度組小鼠在d13時對耳部的搔抓次數(shù)均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；且漆大姑水提取高濃度組小鼠在d10、d13、d16時對耳部的搔抓次數(shù)顯著少于復方醋酸曲安奈德溶液組（P＜0.05），表明漆大姑水提物在達到一定濃度時，止癢效果比復方曲安奈德溶液好，結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠對耳部的搔抓次數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10，次/30 min）Tab 2 Determination results of scratching times of ear in mice in each group（x ± s，n＝10，times/30 min）

表2 各組小鼠對耳部的搔抓次數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10，次/30 min）Tab 2 Determination results of scratching times of ear in mice in each group（x ± s，n＝10，times/30 min）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與復方醋酸曲安奈德溶液組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01；vs.compound triamcinolone acetonide acetate group， ΔP＜0.05

組別空白組模型組復方醋酸曲安奈德溶液組漆大姑水提物高濃度組漆大姑水提物中濃度組漆大姑水提物低濃度組d16 0.8±0.6 47.7±3.1＊＊42.7±2.2##39.3±1.9##Δ 43.9±3.0#45.8±3.6 d0 1.0±0.6 0.8±0.5 0.9±0.7 0.8±0.6 0.7±0.4 0.8±0.8 d10 1.1±1.0 41.1±2.3＊＊37.8±2.7##35.3±3.2##Δ 38.3±1.6##39.3±1.9 d13 0.9±0.7 44.1±2.3＊＊40.3±2.0##38.3±11.6##Δ 40.9±2.6##41.7±2.5#

3.3 小鼠耳腫脹度測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠耳腫脹度顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，復方醋酸曲安奈德溶液組和漆大姑水提物各濃度組小鼠耳腫脹度均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；其中，復方醋酸曲安奈德溶液組和漆大姑水提物高濃度組小鼠的耳腫脹抑制率超過50%，結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠耳腫脹度和耳腫脹抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Ear swelling degree and inhibitory rate of ear swelling in mice in each group（±s，n＝10）

表3 各組小鼠耳腫脹度和耳腫脹抑制率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Ear swelling degree and inhibitory rate of ear swelling in mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組復方醋酸曲安奈德溶液組漆大姑水提物高濃度組漆大姑水提物中濃度組漆大姑水提物低濃度組耳腫脹度，mg 耳腫脹抑制率，%60.3 52.6 39.8 13.8 6.38±1.15＊＊2.53±0.61##3.02±0.71##3.84±0.63##5.50±0.78#

3.4 小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），脾指數(shù)顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，復方醋酸曲安奈德溶液組和漆大姑水提物高濃度組小鼠的胸腺指數(shù)以及復方醋酸曲安奈德溶液組和漆大姑水提物各濃度組小鼠的脾指數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Determination results of thymus index and spleen index in mice in each group（±s，n＝10）

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 4 Determination results of thymus index and spleen index in mice in each group（±s，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組復方醋酸曲安奈德溶液組漆大姑水提物高濃度組漆大姑水提物中濃度組漆大姑水提物低濃度組脾指數(shù)，g/10 g 0.321±0.022 0.331±0.036＊0.164±0.020##0.268±0.016##0.279±0.023##0.300±0.026##胸腺指數(shù)，g/10 g 0.316±0.012 0.322±0.037 0.278±0.034##0.287±0.026#0.298±0.045 0.305±0.026

3.5 小鼠耳片組織病理學觀察結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠耳表皮棘層明顯增厚，細胞明顯增生，表皮中可見海綿樣水腫，周圍可見明顯的炎性細胞浸潤，表皮細胞角化過度；真皮中血管明顯充血，周圍可見淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤。復方曲安奈德溶液組小鼠耳表皮局部可見棘層輕微增厚，表皮未見海綿樣水腫也未見水泡；真皮下血管周圍未見明顯的淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤。漆大姑水提物高濃度組小鼠耳表皮棘層稍微增厚，可見輕微海綿樣水腫；真皮血管周圍可見少量淋巴細胞及嗜酸性粒細胞的浸潤。漆大姑水提物中濃度組小鼠耳表皮層棘層增厚，可見海綿樣水腫，但未見水泡；真皮下血管周圍可見淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，血管輕微充血。漆大姑水提物低濃度組小鼠耳表皮棘層明顯增厚，可見海綿樣水腫，細胞角化過度；真皮血管周圍可見明顯淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤，血管充血，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠耳組織大體觀察結(jié)果Fig 1 General observation of ear tissue of mice in each group

圖2 各組小鼠耳組織病理學觀察結(jié)果（×400）Fig 2 Pathological observation of ear tissue of mice in each group（×400）

4 討論

慢性皮炎-濕疹為人類常見病、多發(fā)病，其發(fā)病機制與機體遲發(fā)型變態(tài)反應有關(guān)。本研究采用DNCB致敏并反復激發(fā)復制小鼠慢性皮炎-濕疹模型，造模后小鼠耳廓局部病理特征與文獻報道[10-13]基本一致，提示造模成功，而且局部病理改變與人類慢性皮炎-濕疹類似，可用于評價藥物療效。復方醋酸曲安奈德溶液為糖皮質(zhì)激素藥，是目前公認的有效治療慢性皮炎、慢性濕疹等過敏性皮膚病的常用外用藥，故在本研究中筆者以其為陽性對照。

胸腺是T淋巴細胞發(fā)育成熟的場所，是機體中樞免疫器官，主要參與細胞免疫；脾是身體最大的外周免疫器官，含有大量的免疫細胞，成熟的B淋巴細胞大量聚集于此，因此其與機體的體液免疫關(guān)系更為密切，也更容易受到糖皮質(zhì)激素等藥物的抑制，濕疹患者的細胞免疫及體液免疫功能往往存在顯著異常。臨床試驗和動物研究已經(jīng)證實，免疫功能異常是皮炎-濕疹發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[14-15]。慢性皮炎-濕疹多由急性皮炎-濕疹或亞急性皮炎-濕疹轉(zhuǎn)化而來[16]，機體的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)與體質(zhì)量成正比，是反映胸腺、脾免疫功能的重要指標，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的改變又直接反映了機體免疫功能狀態(tài)的變化[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的胸腺指數(shù)及脾指數(shù)均高于空白組，其中脾指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；各給藥組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均較模型組均不同程度降低，其中尤以脾指數(shù)降低較為明顯，且差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。同時，慢性皮炎-濕疹模型小鼠的病理狀態(tài)也在逐漸改善。這提示機體免疫功能的改變與慢性皮炎-濕疹的發(fā)生密切相關(guān)，漆大姑枝葉水提物能夠降低模型小鼠增加的胸腺指數(shù)及脾指數(shù)，在這方面與復方醋酸曲安奈德溶液藥效相似，其機制可能與免疫抑制作用有關(guān)。遲發(fā)型超敏反應是由特異性致敏效應T細胞介導的細胞免疫應答的一種類型，細胞免疫缺陷和無胸腺的裸鼠不會發(fā)生該型變態(tài)反應[18]，而自身免疫病和過敏反應都是由于免疫系統(tǒng)對外來物質(zhì)異常敏感。因此，筆者推斷，漆大姑水提物對小鼠慢性皮炎-濕疹的防治有可能是通過調(diào)節(jié)免疫功能而發(fā)揮作用的，并非單純的局部作用，至于具體的作用機制還有待進一步研究。

陳蕾等[19]和Yamashita H等[20]在研究中均發(fā)現(xiàn)，慢性皮炎-濕疹模型組小鼠在激發(fā)后各時間點搔抓耳部的次數(shù)明顯多于空白對照組，搔抓動作時程與遲發(fā)型變態(tài)反應過程類似，而且空白對照組小鼠幾乎沒有搔抓耳部的動作，因而認為DNCB誘發(fā)的搔抓行為是皮膚的遲發(fā)型變態(tài)反應伴隨發(fā)生的瘙癢反應。所以在本研究中，另外增加了小鼠30 min內(nèi)搔抓右耳次數(shù)這一觀察項目，可直觀地反映受試藥物對模型小鼠的止癢效果。在臨床中，“瘙癢-搔抓-苔蘚化”的惡性循環(huán)狀態(tài)是慢性皮炎-濕疹患者的常見表現(xiàn)，控制瘙癢是減輕痛苦的關(guān)鍵。采用藥物外用治療時，藥物要穿透皮膚角質(zhì)層到達病灶才能起作用，故在藥物外用時應考慮到增加藥物對皮膚的滲透力和止癢力，因為劇烈的瘙癢是慢性皮炎-濕疹患者最主要的困擾癥狀，所以外用藥的止癢作用一定要明顯有效、止癢起效時間短，故本研究中各濃度的漆大姑水提物中均含有體積分數(shù)為7%的1，2-丙二醇作為透皮促進劑[21]，可增強受試藥對皮膚角質(zhì)層的滲透能力，較好地發(fā)揮藥物療效。本研究結(jié)果還顯示，高濃度漆大姑水提物在改善慢性皮炎-濕疹模型小鼠耳腫脹度及淋巴細胞浸潤方面稍遜于復方醋酸曲安奈德溶液，但在減少模型小鼠搔抓次數(shù)方面強于復方醋酸曲安奈德溶液（P＜0.05），表明漆大姑水提物在達到一定濃度后止癢效果較好。

由于皮炎濕疹病位在表，病灶外露，通過中藥外用治療患部，藥物的有效成分能經(jīng)由皮膚、汗腺、毛囊吸收后直達病灶部位，提高病灶部位的藥物有效濃度，療效穩(wěn)固、持久，既避免了內(nèi)服藥物的首關(guān)效應和不良反應，又提高了藥物的療效和患者用藥的依從性。而且外用藥物還可以通過肌腠毛竅，轉(zhuǎn)運至全身，同時達到內(nèi)外共治作用[22-23]。本研究在用藥期間，小鼠脾指數(shù)的顯著變化可能與此有關(guān)。

綜上所述，漆大姑水提物對慢性皮炎-濕疹模型小鼠具有較好的改善作用，可通過抑制炎癥、消腫止癢來改善癥狀，并可明顯地抑制免疫器官指數(shù)的增加，有望開發(fā)成一種治療慢性皮炎-濕疹的外用藥物，但其具體的作用機制還有待進一步研究。

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