蠅蛆油對急性皮膚創(chuàng)傷感染模型大鼠愈合的影響及機制研究Δ

韓躍東，張超，張松，張衍國（1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院皮膚科，西安7100；.西安市第三醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 71008；.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，西安 7100）

皮膚創(chuàng)面愈合是一個極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，大致包括細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、創(chuàng)面收縮、膠原生成等過程[1]。在創(chuàng)面愈合過程中，創(chuàng)面感染會使愈合延遲，嚴(yán)重時還會造成嚴(yán)重的菌血癥，威脅患者生命[2]。因此，在有效控制感染的同時促進創(chuàng)面愈合，是治療皮膚創(chuàng)傷的重要環(huán)節(jié)。近年來，臨床常用抗生素控制皮膚創(chuàng)傷感染，但抗生素不僅易引起過敏性休克，還有可能引起二重感染，此外耐藥菌的產(chǎn)生也嚴(yán)重困擾著臨床醫(yī)師和藥師[3]。因此，開發(fā)兼具抗感染和促愈合的新型藥物具有重要意義。

蠅蛆又名五谷蟲，是麗蠅科絲光綠蠅和大頭金蠅的幼蟲，為我國傳統(tǒng)中藥材，其體內(nèi)具有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素和氨基酸類成分，營養(yǎng)價值高于魚類，可用于某些氨基酸缺乏癥或其他多種疾病的防治[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，蠅蛆油可抑制炎癥反應(yīng)，對綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強的抑菌作用，對深Ⅱ度燙傷模型小鼠及鹽酸引起的化學(xué)性損傷和燒傷具有顯著的保護作用[6-7]。但是，目前還未見關(guān)于蠅蛆油對急性皮膚創(chuàng)傷感染的保護作用及作用機制的文獻報道。故本研究通過對大鼠復(fù)制創(chuàng)傷感染模型，研究蠅蛆油對急性皮膚創(chuàng)傷感染的保護作用及機制，為蠅蛆油的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Infinite F50全自動酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Chem Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)、Mini Protein Tetra Cell蛋白電泳槽（美國Bio Rad公司）。

1.2 試劑

京萬紅（天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，批號：211761，規(guī)格：20 g/支）；羥脯氨酸（批號：20170219）、大鼠溶菌酶（批號：20170122）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：20170214）和白細(xì)胞介素6（IL-6，批號：20170218）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化NF-κB 抑制因子（p-IκB-α）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自美國 Cell Signaling Technology公司；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司）；石油醚（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20160729，分析純）；氯胺酮注射液（美國Sigma公司，批號：H35020148，規(guī)格：0.1 g/2 mL）。

1.3 動物

清潔級SD大鼠280只，♀♂各半，體質(zhì)量180～220 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心[動物生產(chǎn)合格證號：SCKX（軍）2007-007號]。購入后將大鼠飼養(yǎng)于為室溫為（25±2）℃、濕度為65%～75%的環(huán)境中，普通飼料喂養(yǎng)。4～5日齡蠅蛆幼蟲由西安福如林生物技術(shù)有限公司提供。

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌由唐都醫(yī)院檢驗科提供。

2 方法

2.1 蠅蛆油的提取

取4～5日齡蠅蛆幼蟲，精密稱量10 g，充分碾磨后，用100 mL石油醚浸泡，每次6 h，重復(fù)3次，合并浸提液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低溫下（30℃）減壓揮干石油醚，在真空干燥器中干燥至恒質(zhì)量，蠅蛆油的得率為12.7%。

2.2 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為正常組（創(chuàng)傷表面涂生理鹽水）、模型組（創(chuàng)傷表面涂生理鹽水）、蠅蛆油組（測試藥物組）、京萬紅組（陽性對照組），每組70只。除正常組外，其余各組大鼠均參考文獻[8]方法復(fù)制皮膚急性創(chuàng)傷感染模型：腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）麻醉大鼠，用脫毛膏去除背部毛發(fā)，洗凈后，用碘酒給皮膚消毒，切開長為1.5 cm傷口，深至皮下。在傷口處涂上1 mL（1.2×109mL－1）的金黃色葡萄球菌懸液，每天上午涂1次，連續(xù)3 d。參考國家衛(wèi)生部醫(yī)改司醫(yī)院感染檢測小組制訂的醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，以傷口出現(xiàn)紅腫熱痛并有膿液即提示造模成功。造模成功后，每天9：00和17：00各給藥1次，給藥劑量為0.3 mL/100 g（給藥劑量參考文獻[6]報道的給藥劑量以及前期預(yù)實驗結(jié)果確定），連續(xù)給藥15 d。

2.3 創(chuàng)面大體情況觀察

每日觀察用藥后大鼠皮膚創(chuàng)面情況，包括是否水腫、有無紅腫、有無瘢痕、表面是否干燥平整，記錄愈合時間。皮膚愈合判斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：皮膚完整，無水腫、無膿液滲出。

2.4 創(chuàng)面含水量及組織中羥脯氨酸含量測定

給藥1、2、4、6、8 d后，每個時間點每組選10只大鼠，收集背部皮膚。采用干濕比法測定給藥2、4、6、8 d后大鼠創(chuàng)面含水量：取創(chuàng)面組織，清除皮下脂肪組織，精確稱量，記為濕質(zhì)量；剪碎組織，在烘箱（100℃）中烘烤24 h，精確稱量，記為干質(zhì)量，創(chuàng)面含水量＝（濕質(zhì)量－干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。取干燥后的皮膚組織（給藥1、2、4、6、8 d后的大鼠皮膚組織）7 mg，用6 mol/L的HCl溶液在120℃下水解15 h，用去離子水稀釋裂解物，并用NaOH（1 mol/L）溶液中和，將裂解物以1 000×g離心15 min，收集上清液，用于羥脯氨酸含量測定，具體操作依照試劑盒說明書進行。

2.5 血清中溶菌酶含量測定

末次給藥結(jié)束2 h后，每組取10只大鼠，麻醉后收集血液，在室溫下將血液以1 000×g離心10 min，收集血清；每只大鼠取20 μL血清，按照試劑盒說明書操作，應(yīng)用雙抗體夾心法測定血清中溶菌酶含量。待反應(yīng)結(jié)束后，采用全自動酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各樣品的吸光度（OD）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠溶菌酶含量。

2.6 血清中TNF-α、IL-6含量測定

末次給藥結(jié)束2 h后，每組取10只大鼠，收集大鼠血液，將血液以1 500×g離心10 min，收集上清液。按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，測定各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量。

2.7 創(chuàng)面組織中NF-κB p65、p-I-κB蛋白表達測定

將大鼠取血后處死，取50 mg皮膚組織，加入組織蛋白勻漿液500 μL，勻漿至無組織塊，冰浴15 min，在4℃條件下以1 500×g離心5 min，收集上清。然后按照說明書要求，加入細(xì)胞漿蛋白提取液，冰浴10～15 min，以10 000×g離心10 min，收集上清液，即為細(xì)胞漿蛋白樣品液。沉淀中加入細(xì)胞核蛋白提取液，冰浴10～15 min，以10 000×g離心10 min后，收集上清液，即為細(xì)胞核蛋白樣品液。用二喹啉甲酸（BCA）法對細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白進行定量，然后置于－70℃保存，備用。蛋白變性后，分別取等量蛋白（30 μg）上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，脫脂奶粉封閉后，用一抗（NF-κB p65、I-κB）孵育過夜，洗膜緩沖液TBST漂洗3遍后，加入羊抗兔二抗（1∶5 000），孵育1 h。TBST漂洗后，采用化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒顯影、拍照。核蛋白檢測以PCNA（1∶1 000）為內(nèi)參，細(xì)胞漿蛋白檢測以β-actin（1∶1 000）為內(nèi)參。采用Quantity one軟件進行條帶灰度值分析，以目的蛋白條帶和內(nèi)參（PCNA或β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平，并將正常組的比值設(shè)置為1。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 創(chuàng)面愈合的觀察結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠創(chuàng)面愈合緩慢，愈合率較低，愈合時間較長[（14.3±2.1）d]。與模型組比較，蠅蛆油組和京萬紅組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著增加，愈合時間顯著縮短[分別為（8.2±2.3）、（9.5±2.5）d]（P＜0.01），創(chuàng)面平整光滑、疤痕面積較小、整潔度較好。

3.2 創(chuàng)面含水量的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠在給藥2、4、6、8 d后創(chuàng)面含水量均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，蠅蛆油組和京萬紅組大鼠在給藥2、4、6、8 d后創(chuàng)面含水量均顯著減少（P＜0.01）。各組大鼠創(chuàng)面含水量測定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面含水量測定結(jié)果（±s，n＝10，%%）Tab 1 Content determination of water in wound of rats in each group（±s，n＝10，%%）

表1 各組大鼠創(chuàng)面含水量測定結(jié)果（±s，n＝10，%%）Tab 1 Content determination of water in wound of rats in each group（±s，n＝10，%%）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組蠅蛆油組京萬紅組8 d 38.7±2.2 66.8±4.2＊＊43.5±3.9##46.3±4.6##2 d 39.5±2.3 85.3±3.6＊＊73.5±4.8##74.3±5.5##4 d 38.1±2.6 78.2±4.1＊＊64.5±5.1##65.3±5.7##6 d 40.3±1.9 70.7±4.6＊＊57.9±4.4##59.1±4.7##

3.3 創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量隨著時間的增加而增加，在給藥4 d后差異開始有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，在給藥后2、4、6、8 d后蠅蛆油組和京萬紅組大鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量顯著增加（P＜0.01），提示蠅蛆油可以促進創(chuàng)面膠原合成，增加創(chuàng)面愈合能力。各組大鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量測定結(jié)果（±s，n＝10，μg/mg）Tab 2 Content determination of hydroxyproline in wound of rats in each group（x ± s，n＝10，μg/mg）

表2 各組大鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量測定結(jié)果（±s，n＝10，μg/mg）Tab 2 Content determination of hydroxyproline in wound of rats in each group（x ± s，n＝10，μg/mg）

注：與正常組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組蠅蛆油組京萬紅組8 d 0.28±0.06 0.55±0.05＊＊1.96±0.18##1.93±0.19##1 d 0.22±0.05 0.26±0.07 0.31±0.04 0.29±0.05 2 d 0.27±0.07 0.33±0.03 0.91±0.08##0.84±0.07##4 d 0.26±0.04 0.41±0.05＊1.42±0.15##1.34±0.13##6 d 0.31±0.05 0.49±0.07＊1.82±0.11##1.74±0.12##

3.4 血清中溶菌酶含量的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中溶菌酶含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，蠅蛆油組和京萬紅組大鼠血清中溶菌酶含量顯著減少（P＜0.01），表明蠅蛆油可以促進創(chuàng)面膠原合成，增強創(chuàng)面愈合能力。各組大鼠血清中溶菌酶含量測定結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清中溶菌酶含量測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Content determination of lysozyme in serum of rats in each group（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血清中溶菌酶含量測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 3 Content determination of lysozyme in serum of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組蠅蛆油組京萬紅組溶菌酶含量，U/mL 1.27±0.21 2.14±0.26＊＊4.78±0.38##4.15±0.27##

3.5 血清中TNF-α和IL-6含量的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，蠅蛆油組和京萬紅組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著減少（P＜0.01）。各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量測定結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量測定結(jié)果（±s，n＝10，ng/L）Tab 4 Content determination of TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n＝10，ng/L）

表4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量測定結(jié)果（±s，n＝10，ng/L）Tab 4 Content determination of TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n＝10，ng/L）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

IL-6 1.04±0.13 3.09±0.65＊＊1.58±0.45##1.66±0.56##組別正常組模型組蠅蛆油組京萬紅組TNF-α 142.5±33.8 369.4±49.7＊＊211.6±41.5##227.4±43.1##

3.6 創(chuàng)面組織中NF-κB p65和p-I-κB-α蛋白表達測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中NF-κB p65（細(xì)胞質(zhì)中）蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），NF-κB p65（細(xì)胞核中）和p-IκB-α（細(xì)胞質(zhì)中）蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，蠅蛆油組和京萬紅組大鼠創(chuàng)面組織中NF-κB p65（細(xì)胞質(zhì)中）蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），NF-κB p65（細(xì)胞核中）和p-IκB-α（細(xì)胞質(zhì)中）蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。各組大鼠創(chuàng)面組織NF-κB p65和I-κB-α蛋白表達電泳圖見圖1，測定結(jié)果見表5。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織中NF-κB p65和p-IκB-α蛋白表達電泳圖Fig 1 Electrophorograms of protein expression of NF-κB p65 and p-IκB-α in wound of rats in each group

4 討論

表5 各組大鼠創(chuàng)面組織中NF-κB p65和p-IκB-α蛋白表達水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 5 Protein expression level of NF-κB p65 and p-IκB-α in wound of rats in each group（±s，n＝10）

表5 各組大鼠創(chuàng)面組織中NF-κB p65和p-IκB-α蛋白表達水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 5 Protein expression level of NF-κB p65 and p-IκB-α in wound of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01

組別正常組模型組蠅蛆油組京萬紅組p-IκB-α 1 2.37±0.21＊＊1.32±0.26##1.26±0.28##NF-κB p65細(xì)胞質(zhì)1 0.35±0.18＊＊0.93±0.22##0.87±0.24##細(xì)胞核1 2.79±0.25＊＊1.24±0.22##1.18±0.24##

皮膚創(chuàng)傷以及繼發(fā)的感染是一種常見的疾病，發(fā)生率較高，如何促進創(chuàng)傷愈合和減輕感染一直以來是廣大醫(yī)藥工作者渴望解決的難題。前期研究發(fā)現(xiàn)，蠅蛆油對抗燒、燙傷和鹽酸燒傷有較好的改善作用，但未見有關(guān)其用于治療皮膚創(chuàng)傷感染的報道[6-8，10]。本研究在大鼠皮膚創(chuàng)傷感染模型上，研究了蠅蛆油的治療效果，并探討了其作用機制。京萬紅是臨床常用的治療燒燙傷的藥物，對皮膚創(chuàng)傷感染也有較好的治療效果[11]，所以本研究以其為陽性對照藥。在本研究中，蠅蛆油可以減輕創(chuàng)傷感染引起的組織水腫，縮短創(chuàng)面愈合時間，并且創(chuàng)面愈合整潔度較好，疤痕形成較少，這表明蠅蛆油可以促進創(chuàng)面愈合，抑制組織水腫。同時，其還可以促進創(chuàng)面組織內(nèi)羥脯氨酸的持續(xù)生成，這提示蠅蛆油促進創(chuàng)面愈合作用可能與促進膠原蛋白合成有關(guān)。另外，筆者還觀察到蠅蛆油給藥組溶菌酶含量顯著高于模型組，這表明蠅蛆油可以促進吞噬細(xì)胞分泌溶菌酶，從而發(fā)揮抗菌作用。

炎癥反應(yīng)是機體修復(fù)損傷組織的一種基本反應(yīng)，是創(chuàng)面修復(fù)的始動環(huán)節(jié)，但過度的炎癥反應(yīng)則會加重組織損傷[12]。過度的炎癥反應(yīng)會使細(xì)胞過度增殖，膠原蛋白大量合成、沉積，使瘢痕過度增生，組織修復(fù)不良[13]。本研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷感染后大鼠血清中TNF-α、IL-6含量明顯增加，表明創(chuàng)傷感染誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)，而蠅蛆油可明顯抑制血清中TNF-α、IL-6的含量，表明蠅蛆油能夠控制炎癥反應(yīng)。正常情況下，NF-κB以二聚體的形式在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與I-κB結(jié)合，處于失活狀態(tài)，而當(dāng)受活性氧或細(xì)菌感染等刺激時，I-κB發(fā)生磷酸化，使NF-κB p65解離和活化，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)下游蛋白表達，使損傷加劇[14-15]。為研究蠅蛆油的作用機制，筆者分別檢測了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65和p-IκB-α蛋白表達情況，以及細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達情況。結(jié)果表明，蠅蛆油可以使p-IκB-α蛋白表達水平降低，促使NF-κB p65由胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中，抑制NF-κB活化，從而抑制過度激活的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，蠅蛆油對急性皮膚創(chuàng)傷感染引起的組織損傷具有一定的改善作用，其機制可能與促進膠原蛋白生成、增加溶菌酶含量和調(diào)節(jié)NF-κB信號通路從而發(fā)揮抗炎作用有關(guān)。

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