燕麥花藥組織培養(yǎng)影響因子研究進展

田娟 張曼 董玉迪 孫墨可 王春龍 沙莉 任長忠

摘要?燕麥花藥組織培養(yǎng)受各種因子的影響，從基因型、供體植株生長條件、花藥的選擇、預處理、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件幾個方面對國內(nèi)外燕麥花藥組織培養(yǎng)研究進展進行綜述，以期為燕麥花藥組織培養(yǎng)提供參考。

關(guān)鍵詞?燕麥;花藥組織培養(yǎng);影響因子

中圖分類號?S188+.2文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2018）35-0011-03

花藥組織培養(yǎng)是用植物組織培養(yǎng)技術(shù)把發(fā)育到一定階段的花藥通過無菌操作技術(shù)接種在人工培養(yǎng)基上，以改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育程序，誘導其分化，并連續(xù)進行有絲分裂，形成細胞團，進而形成一團無分化的薄壁組織——愈傷組織，或分化成胚狀體，隨后使愈傷組織分化成完整的植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)育種具有縮短育種年限、快速穩(wěn)定變異性、提高選擇效率等優(yōu)點[1]。在小麥[2-3]、水稻[4-5]、烤煙[6]、辣椒[7-8]等的育種實踐中，花培技術(shù)已顯示了其應用價值。在國內(nèi)，關(guān)于燕麥花藥組織培養(yǎng)的報道很少，只有孫敬三等[9]用裸燕麥花藥建立了分散好、生長快的單倍體懸浮細胞培養(yǎng)物，現(xiàn)在報道的關(guān)于燕麥的組織培養(yǎng)大多是子房[10]、穎片[11]、幼葉[12]、頂端分生組織[13-14]、幼穗[15]、幼胚[16-17]、成熟胚[18-20]、種子和根[21]等。就國外而言，1980年Chung[22]報道了燕麥花藥培養(yǎng)中有愈傷組織的發(fā)生;第1個從燕麥花藥培養(yǎng)中獲得植株的是Rines[23]，他報道了一個燕麥品種CV培養(yǎng)65 000余個花藥，其中2 627個產(chǎn)生愈傷組織，獲得一個單倍體和二倍體植株;Polsoni[24]1991年在燕麥中獲得一些愈傷組織，但沒有獲得植株;Sun等[25]獲得12株綠色植株和一個白化苗植株。以上研究表明用燕麥作花藥組織培養(yǎng)是可行的，但是成功率比較低，燕麥屬植物的花藥組織培養(yǎng)比較難。之所以成功率低、比較困難是因為影響愈傷組織發(fā)生的因素很多，該研究就國內(nèi)外燕麥花藥組織培養(yǎng)研究進展，從基因型、供體植株生長條件、花藥的選擇、預處理、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等方面進行綜述，以期為燕麥花藥組織培養(yǎng)提供參考。

1?基因型

供體植株的基因型是影響花藥和花粉培養(yǎng)的關(guān)鍵因素， 不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應不同，表現(xiàn)為是否可誘導愈傷組織的生成，生成愈傷組織的多少和大小，以及綠苗分化、白化苗的產(chǎn)生等。芬蘭農(nóng)業(yè)研究中心的Kiviharju等[26]對44個燕麥品種（Avena sativa L.）、6個裸燕麥（A sativa L.）、15個野生燕麥（Avena sterilis L.）、5個種內(nèi)雜交（A.sativa.×A.sativa.）和2個種間雜交（A.sativa.×A.sterilis.）進行研究，結(jié)果表明：野生燕麥的出愈率優(yōu)于裸燕麥且只有野生燕麥獲得再生植株，反應了燕麥花藥組織培養(yǎng)受基因型影響很大。2005年楊才等[27]研究發(fā)現(xiàn)燕麥品種間出愈率差異在 0.0%～48.5%，且 F1代出愈率與雙親出愈率的高低相關(guān)性強。Kiviharju等[28]對14個燕麥品種進行花藥組織培養(yǎng)，結(jié)果只有6個基因型獲得再生植株。Noga等[29]對21個不同燕麥雜交組合進行研究，結(jié)果表明愈傷組織大小與基因型顯著相關(guān)，單倍體胚胎的萌發(fā)能力在燕麥基因型之間有顯著差異。

2?供體植株生長條件

即使基因型相符，供體植物的生理狀態(tài)對花藥組織培養(yǎng)也有影響，這取決于生長條件。有報道指出，一些植物在正常生長季節(jié)生產(chǎn)的田間材料要比溫室培養(yǎng)的材料好[30]、健康、有活力的供體植株對于成功的花藥/小孢子培養(yǎng)是必不可少的[31-32]。有時只有在控溫、一定光周期和光強的環(huán)境條件下，花藥才會有反應[33]。Kiviharju等[34]發(fā)現(xiàn)，同一燕麥品種（Aslack）在相同培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件下的綠苗率不同，最可能的原因是供體植株生長條件不同引起的，供體植株培養(yǎng)時的溫度、水分等都相同，唯一不同的是每天有數(shù)小時的自然光照射，在61°S隨著季節(jié)的變化，自然光發(fā)生變化。

3?花粉（花藥內(nèi)的小孢子）的發(fā)育時期

小孢子發(fā)育階段是誘導花粉胚發(fā)育的關(guān)鍵階段。在小孢子發(fā)生的某些階段，小孢子并沒有完全參與配子發(fā)育，可以誘導胚胎發(fā)生[35];最佳敏感的發(fā)育階段因物種而不同，在對植物進行廣泛的研究中，第1次有絲分裂是雄性激素誘導的最佳時期[36]。王子霞等[11]選取花粉處于單核中晚期燕麥穗子的穎片進行離體培養(yǎng)，獲得再生植株。Sidhu等[37]選取處于單核中期的燕麥幼穗進行小孢子離體培養(yǎng)，首次從離體燕麥小孢子中獲得再生綠色植株。Ferrie[33]以燕麥2000QION43品系為材料，選取單核晚期至雙核早期的幼穗獲得愈傷組織和再生植株，通過以上研究發(fā)現(xiàn)，燕麥誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期是單核中后期至雙核早期。

4?預處理

4.1?冷處理

1998年Kiviharju等[38]對燕麥Stout在4 ℃條件下處理0、7、14、21、28 d，結(jié)果處理7 d的愈傷組織最多，達到6.3%，表明7 d冷處理對Stout 的出愈水平略有提高;Sidhu等[37]對燕麥小孢子進行6～9周的4 ℃冷處理，獲得2棵綠苗和15棵白化苗，研究發(fā)現(xiàn)，冷處理時間與多細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的數(shù)量呈正相關(guān)，但長期的冷處理可能導致白化苗頻率升高。Ferrie等[33]研究表明，使用0.3 mol/L甘露醇預處理收集的分蘗幼穗，在4 ℃下保持7 d，可產(chǎn)生比用水處理的分蘗獲得更多的1～2 mm 胚胎，盡管用2種方法處理后愈傷組織發(fā)育的數(shù)量沒有顯著差異，但是甘露醇處理比水處理產(chǎn)生的綠苗增多，且白化苗病株減少。

4.2?熱處理

Kiviharju等[38]在32 ℃條件下對分離出的花藥處理5 d，裸燕麥WW18019（A sativa L.）和野生燕麥（Avena sterilis L.）CAV264815出愈率比較好。以后一些相關(guān)研究人員都繼續(xù)做相關(guān)處理[34，39]。

5?培養(yǎng)基

燕麥花藥培養(yǎng)效率的提高， 在很大程度上依賴于培養(yǎng)基成分、 激素配比以及培養(yǎng)基pH不同來實現(xiàn)的，可以說培養(yǎng)基的改良一直處于主導地位。

5.1?基礎培養(yǎng)基

花藥組織培養(yǎng)使用的基本培養(yǎng)基有大量元素、微量元素、維生素、糖類和生長因素等。培養(yǎng)基的組成在胚胎發(fā)生中起著主要的作用。經(jīng)過前人的多年研究，N 6、KFWC、MS、W 14、FHG、TM、NLN、190-2、B5 等都用于燕麥花藥培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基[29-40]。其中常用且效果比較好的誘導培養(yǎng)基有KFWC、W 14和190-2，再生培養(yǎng)基一般為MS和W14。Ferrie等[33]以燕麥2000QION43品系為材料，對W 14、FHG、TM、NLN、KFWC這 5種誘導培養(yǎng)基進行燕麥花藥培養(yǎng)對比試驗，結(jié)果表明相較于其他培養(yǎng)基，對于燕麥花藥組織培養(yǎng)KFWC、W 14培養(yǎng)基表現(xiàn)效果比較好。對MS，W14和B5這3種再生培養(yǎng)基進行比較，W14綠苗率最高（88%），其次是MS（82%），最差是B5（73%），相比之下W14的白化苗率最低。

5.2?激素配比及附加成分

Kiviharju等[26]報道燕麥栽培種、野生種以及它們的雜交種的花藥培養(yǎng)，研究 2，4-D 、 KT對植株再生能力的影響，結(jié)果表明生長激素抑制燕麥（Avena sativa L）愈傷的出現(xiàn)，而在裸燕麥（A.sativa L.）、野生燕麥（Avena sterilis L.）和雜交后代（A.sativa.×A.sterilis.）中加入1.0 mg/L 2，4-D的誘導培養(yǎng)基會促進愈傷組織的出現(xiàn);Rines[16]在未授粉子房的培養(yǎng)中，認為2 ，4-D 和 KT 聯(lián)合作用反而降低愈傷組織的誘導率;Kiviharju等[39]研究不同激素及附加成分對再生植株的影響，獲得22株綠苗，其中13株存活（11株單倍體，2株雙單倍體），37株白化苗，結(jié)果表明：誘導培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L 2，4-D和0.1 mg/L KT時出愈率最高，促進愈傷組織的分化。但是6-BA能夠促進白化苗的產(chǎn)生。與蔗糖相比，麥芽糖作為碳源，WW18019和Stout的出愈率更高;Kiviharju等[34]以Lisbeth 和Aslack為材料，以W14為基本培養(yǎng)基，對比30多個添加不同激素配比和附加成分的組合，發(fā)現(xiàn)與僅含2，4-D和KT相比，添加 2，4-D、BAP、乙烯利、L半胱氨酸和肌醇能夠提高植株的再生率;Noga等[29]比較不同培養(yǎng)基對胚胎再生能力的影響，設置了不同激素配比，其中大多數(shù)單倍體胚胎在1mg/L ZEA+0.5 mg/L NAA中能夠再生。以上研究證明不同燕麥品種在同一激素配比中誘導結(jié)果不同，同一燕麥品種在不同培養(yǎng)基上反應結(jié)果也不同，所以不同燕麥品種有其最適的培養(yǎng)體系。

5.3?培養(yǎng)基的pH

培養(yǎng)基的pH影響植物體細胞胚胎誘導和發(fā)育[41]。有報道指出，燕麥花藥組織培養(yǎng)的pH為5.8或者6.0[34，39];Sidhu等[37]指出使用pH 8.0的培養(yǎng)基比pH 5.8的培養(yǎng)基誘導出更多的愈傷組織，但是高pH培養(yǎng)基不支持細胞的持續(xù)生長，促進愈傷組織的褐化。Ferrie等[33]認為培養(yǎng)基pH和愈傷組織的數(shù)量相關(guān)，較高的pH水平（7.0和7.5）產(chǎn)生的愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量明顯優(yōu)于較低的pH水平（4.5、5.0、5.8）。

6?培養(yǎng)條件

6.1?培養(yǎng)溫度

體外胚胎發(fā)生可受小孢子的分離后條件的影響。許多研究都集中在適當?shù)呐囵B(yǎng)溫度及其持續(xù)時間，不同物種之間也存在差異。Polsoni[24]研究發(fā)現(xiàn)，在25～30 ℃下燕麥花藥愈傷組織的誘導比較好，Kiviharju 等[34]發(fā)現(xiàn)誘導愈傷組織的溫度可以達到30 ℃，30 ℃時出愈率最高，但是28 ℃是綠苗的最佳溫度。Ferrie等[33]研究表明，在28 ℃下燕麥小孢子培養(yǎng)具有較高的再生率。

6.2?培養(yǎng)光照

Kiviharju等[34]指出，燕麥Lisbeth在誘導期，黑暗培養(yǎng)比弱光培養(yǎng)[16/8，40 μmol/（m2·s）]提高愈傷組織的出愈率和再生苗率，但燕麥Aslack在黑暗和弱光下培養(yǎng)沒有統(tǒng)計學上的差異。表明基因型對光反應是有差異的。Ferrie等[33]指出在誘導期間的黑暗對綠色植物生產(chǎn)更有效。

6.3?培養(yǎng)密度

小孢子和花藥的密度是培養(yǎng)中的一個重要因素，它影響愈傷組織的質(zhì)量和數(shù)量。當用小孢子培養(yǎng)時，小孢子密度一般為1×106個/mL時能夠獲得的愈傷組織較多，質(zhì)量最好[33，36];當用花藥直接培養(yǎng)時，一般花藥的密度是30個/皿（直徑3.5 cm）[34，38-39]。

7?討論及展望

燕麥花培品種與常規(guī)育種品種相比不僅縮短了育種年限，而且品質(zhì)好，但在實際生產(chǎn)中采用花藥單倍體育成的燕麥新品種很少，沒能夠充分發(fā)揮其優(yōu)勢。其原因是影響燕麥花藥組織培養(yǎng)的因子很多，存在顯著的基因型依賴性、出愈率差、綠苗分化率較低、褐化、白化、玻璃化現(xiàn)象嚴重等。同時單倍體加倍率不高和與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合程度不高，也是限制其發(fā)展的主要因素。因此，大范圍收集、篩選具有優(yōu)良花培特性的燕麥基因型材料是發(fā)展花藥培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵所在;提高花培效率，優(yōu)化培養(yǎng)流程和培養(yǎng)條件，加強技術(shù)和育種材料的交流能夠推動花藥培養(yǎng)技術(shù)的進一步發(fā)展;最后加強與誘變技術(shù)、遠緣雜交、分子標記輔助選擇、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)相結(jié)合，將會提升花藥的培養(yǎng)效率。隨著下一代測序技術(shù)、高通量篩選突變體等現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，燕麥雙單倍體材料（DH）的創(chuàng)制就顯得尤為重要。

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