黑大豆種子球蛋白提取及SDS-PAGE分析

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(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

大豆為豆科植物，因其種皮顏色不同分為黃大豆和黑大豆，黑大豆可藥食兩用，在我國由南到北28個省市有廣泛的分布[1]。黑大豆種子中蛋白質含量豐富，占比可達36%～40%，并居豆類之首[2-3]。有關黑大豆種子球蛋白的提取研究目前所見報道較少，本實驗對黑大豆種子球蛋白的提取及電泳體系進行了研究，旨在建立黑大豆種子球蛋白提取的簡單易行的優(yōu)化體系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

在市場上購買黑大豆種子并研磨成粉末用于實驗。

表2 實驗安排

溫度(℃)405060試管號147258369固液比1∶71∶101∶131∶71∶101∶131∶71∶101∶13時間(h)123231312提取液濃度(%)ABCBCACAB

1.2 實驗方法

1.2.1 黑大豆種子球蛋白的提取

采用三水平四因素的正交試驗，如表1所示。提取液分為3組，每組分為3個濃度梯度，用A、B、C表示。第一組為A：0.5%NaCl、B:1.0%NaCl、C：1.5%NaCl；第二組為A：2.0%NaCl、B：2.5%NaCl、C：3.0%NaCl；第三組為A：3.5%NaCl、B：4.0%NaCl、C：4.5%NaCl。

表1 正交實驗設計

因素水平固液比(g/mL)溫度(℃)時間(h)提取液濃度(%)11∶7401A21∶10502B31∶13603C

按表2進行實驗，水浴結束后將試管內的溶液移至離心管中，6 000 r/min離心15 min棄去沉淀，測定上清液中黑大豆球蛋白含量。

1.2.2 電泳實驗

采用SDS-PAGE法進行電泳實驗，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%。

2 結果與分析

2.1 黑大豆球蛋白的提取及分析

圖1為第一組提取液(NaCl濃度分別為A：0.5%、B:1.0%、C：1.5%)提取黑大豆種子球蛋白的實驗結果，通過極差計算可以看出，4種因素對黑大豆球蛋白提取的影響有所不同，其中固液比對提取影響較大，極差為0.354，影響較小的是提取液的濃度，極差為0.055。

圖1 第一組提取液提取黑大豆球蛋白實驗結果

圖2為第二組提取液(A：2.0%NaCl、B：2.5%NaCl、C：3.0%NaCl)提取黑大豆種子球蛋白的實驗結果，4種因素固液比、溫度、時間和提取液濃度對提取體系影響的極差相應為0.169、0.151、0.089和0.045，與第1個提取體系一致的是固液比對提取影響較大，影響最小的因素是提取液濃度。

圖2 第二組提取液提取黑大豆球蛋白實驗結果

圖3為第三組提取體系(A：3.5%NaCl、B：4.0%NaCl、C：4.5%NaCl)對黑大豆種子球蛋白提取的實驗結果，通過極差分析可見，對提取影響較大的因素是固液比，極差是0.295，影響較小的因素是溫度極差為0.023。

圖3 第三組提取液提取黑大豆球蛋白實驗結果

2.2 SDS-PAGE分析

圖4～圖9分別顯示了3個提取體系所提取的黑大豆種子球蛋白SDS-PAGE圖譜，從圖譜可以看出，不同的提取體系相同的上樣量及同一提取體系不同的上樣量，所得到的電泳圖譜的電泳條帶數量和清晰度均出現了不同。對于同一個提取體系均表現出10μL上樣量的電泳條代數多于7μL上樣量的電泳條帶數，并有較好的清晰度。而在相同上樣量的情況下，第三組提取液所提取的黑大豆球蛋白的電泳圖譜條帶數量較多且較清晰。

圖4 第一組10 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖5 第一組7 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖6 第二組10 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖7 第二組7 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖8 第三組10 μL上樣混合液1～9號管電泳圖譜

圖9 第三組7 μL上樣混合液1-9號管電泳圖譜

3 結 論

不同提取條件對黑大豆種子球蛋白提取有不同影響，本研究所設置的不同提取體系中對提取影響最大的因素是一致的，均為固液比，但影響最小的因素有所不同，第一組和第二組為提取液濃度，第三組為溫度。在本實驗的處理體系中，對于黑大豆球蛋白SDS-PAGE最優(yōu)化的體系是：提取液濃度為4.0%NaCl、固液比為1∶7、提取溫度為50 ℃、提取時間為2 h、上樣量為10μL的電泳體系。

參考文獻：

[1]袁利鵬,楊君,賴來展,等.黑大豆營養(yǎng)功能及開發(fā)豆皮色素的探討[J].農產品加工·學刊,2009,160(1):49-52.

[2]龍偉,靳瑾,沈秀,等.新體系評價東北黑大豆的營養(yǎng)健康功效[J].大豆科學,2014,3(6):915-919.

[3]江甜,何毅,祝振洲,等.黑豆蛋白的分級提取及黑豆花色苷的成分鑒定[J].食品科學,2017:38(4):217-221.

[4]張艷馥,任艷波,沙偉,等.大豆種子醇溶蛋白的提取及 SDS-PAGE分析[J].種子,2015,34(11):41-43.