基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建FOXA2表達(dá)示蹤體系

程浩杰 張振旺 譚桂湘 劉昱翔 卜會(huì)銅 譚擁軍

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082）

2002年，Jansen等［1，2］首次定義了存在于細(xì)菌或古細(xì)菌中的抵御噬菌體入侵感染的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。該系統(tǒng)由成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）結(jié)構(gòu)，以及CRISPR相關(guān)的蛋白 質(zhì)（CRSPR-associated protein，Cas9） 組 成［3，4］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)大體分為三個(gè)類型，其中的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需一種Cas9蛋白就能獨(dú)立對(duì)靶DNA有效切割［5］。該系統(tǒng)依賴質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的一段單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）和其序列互補(bǔ)的靶DNA形成RNA-DNA復(fù)合物來(lái)決定CRISPR/Cas9核酸酶特異性［6］。由于該系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需完成一個(gè)克隆改變Cas9質(zhì)粒的小段gRNA前序列即可特異性靶向切割，并且適用范圍廣闊，目前已有報(bào)道在動(dòng)物［7-8］、植物［9-11］、微生物［12-13］和病毒［14-15］等都具有顯著的切割活性。該系統(tǒng)靶向切割細(xì)胞基因組后，細(xì)胞利用自身同源性定向修復(fù)（Homology directed repair，HDR）機(jī)制實(shí)現(xiàn)帶有同源臂的外源序列插入，是目前染色質(zhì)定向改造主要方式之一。

基因 FOXA2［16］，曾用名是 HNF3β，定位于人染色體中20p11，全長(zhǎng)45 kb，包含3個(gè)外顯子以及兩個(gè)內(nèi)含子。其蛋白長(zhǎng)度為457個(gè)氨基酸。FOXA2蛋白屬于叉頭框（Fox）家族的成員。因該家族蛋白具有一組高度保守的翼狀螺旋區(qū)域，主要特征是作為轉(zhuǎn)錄因子作用于DNA結(jié)合區(qū)域，所以又稱為轉(zhuǎn)錄因子FOXA2。Fox家族蛋白最先被發(fā)現(xiàn)于胚胎發(fā)育的進(jìn)程中，深入研究發(fā)現(xiàn)Fox家族蛋白在免疫調(diào)節(jié)，周期調(diào)控等多個(gè)生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子之一的FOXA2近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)與能量代謝、胰腺發(fā)育、癌癥與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）等都有緊密的關(guān)系［17，18］。

完成基因FOXA2的內(nèi)源性示蹤且不干擾基因本身的轉(zhuǎn)錄翻譯與蛋白質(zhì)修飾，是一種很好的追蹤FOXA2基因表達(dá)開(kāi)啟與關(guān)閉的方法。對(duì)于尋找FOXA2基因的通路相關(guān)基因、互作蛋白、潛在靶向藥物與抑制劑等都有很好的前景。在FOXA2的獨(dú)立開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）后，我們選擇在該基因第3個(gè)外顯子的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）后插入綠色熒光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）EGFP Donor（IRES+EGFP Sequences）序列。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site，IRES）功能是招募核糖體對(duì)后面EGFP mRNA進(jìn)行翻譯。本研究通過(guò)探索新型基因編輯CRISPR/Cas9的技術(shù)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物基因序列的高效編輯；通過(guò)構(gòu)建基因FOXA2的綠色熒光蛋白示蹤體系，為實(shí)現(xiàn)與FOXA2相關(guān)的代謝、腫瘤、免疫等深入研究提供便捷有效的材料工具。

1 材料與方法

1.1 材料

CRISPR/Cas9真核表達(dá)載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Addgene plasmid # 42230）；HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中科院典藏細(xì)胞庫(kù)、乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)自TACC；BbsI、XbaI、EcoR I限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于GIBCO公司；胎牛血清（FBS）為Hyclone公司產(chǎn)品；Anti-FOXA2（ab60721）、Anti-β-actin（HRP）（ab49900）抗體購(gòu)自abcam公司；Anti-Mouse（HRP）（Catalog170-6516） 購(gòu) 自 BIO-RAD公 司；Anti-GFP（AF1483）、Anti-Rabbit（HRP）（A0208）購(gòu)自Beyotime公司。

1.2 方法

1.2.1 Cas9/gRNA靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)以及真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)真核表達(dá)載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9識(shí)別的前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM） 位 點(diǎn) NGG， 質(zhì)粒表達(dá)的gRNA特異性互補(bǔ)識(shí)別PAM位點(diǎn)及其上游20 bp核酸序列。Cas9核酸酶在PAM位點(diǎn)上游第3位和第4位堿基間切開(kāi)以形成平末端切口。例如5'-NNNNNNNNNNNNNNNNN ▲ NNNNGG-3'。gRNA靶位點(diǎn)的選擇參考麻省理工學(xué)院在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/，選取在線網(wǎng)站Score較高的序列。經(jīng)HEK293T細(xì)胞中靶向位點(diǎn)活性檢測(cè)，最終確定靶向位點(diǎn)，位于人染色體20p11，F(xiàn)OXA2基因第3個(gè)外顯子中，CDS區(qū)后（圖1）。

用BbsI酶切表達(dá)載體pX330-U6-Chimeric_BBCBh-hSpCas9，以求表達(dá)載體質(zhì)粒線性化。結(jié)合BbsI酶切后粘性末端堿基，設(shè)計(jì)靶向gRNA序列克隆引物：Cas9-FOXA2-F，Cas9-FOXA2-R（帶下劃線為粘性末端序列堿基）。將兩條引物梯度退火至使雙鏈互補(bǔ)結(jié)合。T4連接酶連接上述互補(bǔ)序列與已線性化的表達(dá)載體（圖2-B）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α涂板，挑取單菌落，質(zhì)粒小提。表達(dá)載體測(cè)序鑒定。測(cè)序引物為Cas9-U6-F。示蹤核酸序列供體DNA片段 EGFP Donor引 物 ：Donor-F，Donor-R。Donor引物中帶下劃線為20 bp同源臂序列（表1）。

表1 載體構(gòu)建及測(cè)序引物

圖1 CRISPR/Cas9靶向FOXA2插入IRES+EGFP

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及陽(yáng)性細(xì)胞分選 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，傳代至六孔板，細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪板70%。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染靶向FOXA2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（簡(jiǎn)寫(xiě) 為 Cas9-FOXA2）3 μg和 DNA 片 段 EGFP Donor 500 ng，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空靶表達(dá)質(zhì)粒Cas9-NG 3 μg及DNA片段EGFP Donor 500 ng。用含10%的FBS和1%雙抗（工作濃度100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%濃度CO2、細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后汞燈下觀察細(xì)胞熒光，拍照，并以綠色熒光為標(biāo)志物，取陰性對(duì)照組做陰性參考進(jìn)行流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)（Fluorescence activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS）分選。以單孔單細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，梯度有限稀釋分選后的細(xì)胞至96孔板。同上培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)被編輯的單克隆細(xì)胞至細(xì)胞適當(dāng)密度，傳代富集。

1.2.3 基因組PCR鑒定 于基因組序列靶向切口上游76 bp（引物末端堿基開(kāi)始至切口處）設(shè)計(jì)引物T-U，切口下游62 bp（切口處至引物前端）設(shè)計(jì)引物T-D。理論上編輯成功的細(xì)胞檢測(cè)PCR片段長(zhǎng)度為1 504 bp。引物序列信息，見(jiàn)表2。取FACS分選、富集的單克隆細(xì)胞提取基因組DNA。以不同單克隆細(xì)胞基因組DNA為模板，上述引物T-U和T-D，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）。鑒定引物位點(diǎn)見(jiàn)圖1。

表2 基因組PCR引物

1.2.4 示蹤體系的驗(yàn)證 相較于正常細(xì)胞，被成功編輯的細(xì)胞MCF-7 KI-EGFP，理論上在細(xì)胞內(nèi)具有示蹤FOXA2基因開(kāi)啟或關(guān)閉的能力。腫瘤細(xì)胞的EMT是腫瘤細(xì)胞喪失上皮表型至獲得間質(zhì)表型并同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲能力的過(guò)程，此過(guò)程重要的調(diào)控基因FOXA2會(huì)伴隨著細(xì)胞上皮型至間質(zhì)型的轉(zhuǎn)化表達(dá)量逐漸下降甚至部分關(guān)閉。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF）具有誘導(dǎo)腫瘤上皮型細(xì)胞向腫瘤間質(zhì)型細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。因此我們?cè)O(shè)計(jì)使用EGF誘導(dǎo)編輯鑒定的上皮表型單克隆細(xì)胞株MCF-7 KI-EGFP來(lái)驗(yàn)證示蹤體系。

細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平（mRNA expression levels）驗(yàn)證基因FOXA2示蹤體系。胰酶消化FACS分選、富集的單克隆細(xì)胞，并提取細(xì)胞總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄方法，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。測(cè)定對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞FOXA2表達(dá)量差異。

蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）驗(yàn)證基因FOXA2示蹤體系。胰酶消化FACS分選、富集的單克隆細(xì)胞，并提取細(xì)胞總蛋白。正常MCF-7細(xì)胞總蛋白作為陰性對(duì)照。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組上樣相同蛋白量約30 μg，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白β-actin 表達(dá)量差異確定上樣平衡。測(cè)定對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白中FOXA2蛋白的表達(dá)量差異。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體以及同源重組片段的克隆、鑒定

真核表達(dá)載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBhhSpCas9原始載體的酶切表明，被限制性核酸內(nèi)切酶BbsI線性化的表達(dá)載體呈現(xiàn)一條8 506 bp的單鏈，被限制性核酸內(nèi)切酶XbaI、EcoR I雙酶切后呈現(xiàn)5 095 bp和3 411 bp雙片段（圖2-A）。靶向FOXA2的真核表達(dá)載體質(zhì)粒設(shè)計(jì)（圖2-B）。測(cè)序結(jié)果表明，靶向FOXA2基因的Cas9-FOXA2克隆成功。同源重組片段EGFP Donor的克隆及純化（圖2-C）。

圖2 靶向FOXA2質(zhì)粒和EGFP Donor的克隆及鑒定

2.2 靶向FOXA2基因座及同源性定向修復(fù)插入報(bào)告基因

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模Y(jié)合靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站篩選出的靶向位點(diǎn)，在FOXA2第三號(hào)外顯子中CDs區(qū)后插入綠色熒光蛋白報(bào)告基因（圖1）。在細(xì)胞面積鋪板70%且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Cas9-FOXA2表達(dá)質(zhì)粒和EGFP Donor報(bào)告基因片段。陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Cas9-NG）原始質(zhì)粒載體和EGFP Donor報(bào)告基因片段。48 h后觀察綠色熒光，經(jīng)FACS分選，傳代后的混合細(xì)胞集群熒光顯著增多（圖3）。根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)量占全細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率＞20%。

圖3 在MCF-7細(xì)胞FOXA2基因中插入綠色熒光蛋白并流式分選富集

2.3 有限稀釋法富集單克隆MCF-7 KI-EGFP細(xì)胞及其鑒定

取FACS分選后的細(xì)胞，于96孔板梯度稀釋（圖4-A）。A1孔為分選后的混合細(xì)胞，從A1孔至H1孔依次梯度稀釋10倍；再?gòu)牡?列至第12列，依次稀釋10倍。旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)96孔板致使單細(xì)胞停落于孔徑中央?yún)^(qū)域，并小心放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)。于細(xì)胞完全貼壁后開(kāi)始分列前，統(tǒng)計(jì)具有單細(xì)胞的孔徑，做好標(biāo)記。培養(yǎng)基添加雙抗并提高血清濃度至15%。等待細(xì)胞生長(zhǎng)分裂，以求編輯的單克隆細(xì)胞的富集，觀察有綠色熒光的孔徑細(xì)胞，做好編號(hào)1 #至10 #。傳代擴(kuò)培，至細(xì)胞數(shù)量增至1×106，取5×105細(xì)胞傳代擴(kuò)培，剩余細(xì)胞提取基因組DNA。以上述基因組DNA為模板，KI位點(diǎn)前后引物T-U和T-D（見(jiàn)表2）擴(kuò)增跨界片段（EGFP Donor片段及其前后部分基因組序列片段）（圖4-B），并純化該P(yáng)CR序列，測(cè)序結(jié)果顯示1 #單克隆細(xì)胞于靶位點(diǎn)發(fā)生有效同源重組。

圖4 FACS分選的陽(yáng)性細(xì)胞梯度有限稀釋及單細(xì)胞基因組PCR鑒定

2.4 MCF-7-KI-EGFP細(xì)胞FOXA2基因示蹤體系的驗(yàn)證

取第1代、第3代、第10代凍存的編輯成功的細(xì)胞株，復(fù)蘇。拍照熒光圖及明場(chǎng)圖，觀察細(xì)胞熒光穩(wěn)定性。結(jié)果（圖5）顯示，綠色熒光傳代具有相對(duì)的穩(wěn)定性，綠色熒光蛋白表達(dá)示蹤FOXA2具有準(zhǔn)確相關(guān)性。

圖5 基因編輯細(xì)胞傳代穩(wěn)定性及誘導(dǎo)驗(yàn)證

取正常MCF-7細(xì)胞傳代鋪板60 mm盤(pán)，2盤(pán)，作為對(duì)照組。鑒定成功的第1代單克隆MCF-7 KIEGFP細(xì)胞1 # 傳代鋪板60 mm盤(pán)，4盤(pán)，為實(shí)驗(yàn)組。傳代密度為50%。待細(xì)胞融合度80%，對(duì)單克隆MCF-7 KI-EGFP 1 #細(xì)胞2盤(pán)，進(jìn)行EGF誘導(dǎo)處理。其余不做處理。EGF工作濃度為100 ng/ml。誘導(dǎo)時(shí)間72 h。

MCF-7 KI-EGFP單克隆細(xì)胞FOXA2轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證。收取對(duì)照細(xì)胞MCF-7、MCF-7 KI-EGFP 1 #及EGF誘導(dǎo)MCF-7 KI-EGFP 1 #三盤(pán)細(xì)胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果（圖5-B）顯示，相較于正常MCF-7細(xì)胞，編輯的單克隆細(xì)胞1 #，F(xiàn)OXA2基因mRNA表達(dá)量有明顯上調(diào)；相較于對(duì)照組MCF-7細(xì)胞，1 #細(xì)胞在EGF誘導(dǎo)處理后，F(xiàn)OXA2基因mRNA表達(dá)量明顯下調(diào)。

MCF-7-KI-EGFP單克隆細(xì)胞FOXA2基因翻譯水平驗(yàn)證。收取對(duì)照組MCF-7、MCF-7 KI-EGFP 1 #以及EGF誘導(dǎo)的MCF-7 KI-EGFP 1 #三盤(pán)細(xì)胞，并提取總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)（圖5-C）顯示，相較于正常MCF-7細(xì)胞，單克隆細(xì)胞MCF-7 KI-EGFP 1 #，具有明顯的FOXA2蛋白表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)；EGF誘導(dǎo)處理的MCF-7 KI-EGFP 1 #細(xì)胞，相較于正常MCF-7細(xì)胞，F(xiàn)OXA2蛋白表達(dá)下調(diào)；相較于未處理的1 #細(xì)胞，EGF誘導(dǎo)處理的1 #細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)明顯減少。

3 討論

FOXA2作為分化因子，在胚胎細(xì)胞向肝細(xì)胞特定分化中具有重要作用［19，20］；在調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝過(guò)程中，F(xiàn)oxa2受胰島素和胰高血糖素的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)，而被AKT信號(hào)磷酸化出核，P300乙?；騂DACs/Sirt1去乙酰化，從而行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下游基因功能［21］；在乳腺癌、肺腺癌等疾病中，F(xiàn)OXA2激活細(xì)胞間粘附因子E-cadherin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并且抑制ZEB2等實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤EMT進(jìn)程［17，18］。實(shí)現(xiàn)基因FOXA2的示蹤，對(duì)于上下游通路基因研究、疾病模型模擬、腫瘤發(fā)生發(fā)展研究具有重要的意義。本研究在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中實(shí)現(xiàn)對(duì)基因FOXA2的示蹤，旨在實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路發(fā)生發(fā)展過(guò)程的探索。

基因編輯CRISPR/Cas9技術(shù)，是近十年快速發(fā)展起來(lái)的靶向核酸新型技術(shù)，作為核酸酶，并經(jīng)人工gRNA改造后理論上可以靶向切割任意匹配核酸序列?；蚓庉嬊捌诎l(fā)展方向，多是圍繞特定基因修飾細(xì)胞株及動(dòng)物轉(zhuǎn)基因模型建立展開(kāi)。隨著研究深入，技術(shù)進(jìn)步目前已實(shí)現(xiàn)在臨床應(yīng)用于急性淋巴白血病、肺癌等人體T淋巴細(xì)胞改造［22］。

在乳腺癌上皮表型MCF-7細(xì)胞中，靶向該細(xì)胞特定基因非編碼基因組區(qū)域研究基因區(qū)域性功能顯示其有效和便捷性［23］。且MCF-7細(xì)胞對(duì)藥篩、誘導(dǎo)等具有很好的響應(yīng)性，是合適的乳腺腔管型腫瘤研究模型，因此我們選取MCF-7作為靶向研究細(xì)胞株。在挑選具有高SgRNA活性靶向位點(diǎn)階段，我們根據(jù)網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/篩選出4個(gè)高分位點(diǎn)，克隆出4個(gè)位點(diǎn)的靶向載體并進(jìn)行HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、靶向區(qū)域的PCR以及T7E1核酸錯(cuò)配內(nèi)切酶的鑒定，來(lái)確定Cas9靶向載體在293T細(xì)胞的切割效率，并選取靶向切割活性最高的SgRNA位點(diǎn)。在基因FOXA2蛋白質(zhì)編碼區(qū)后插入IRES+EGFP序列且不破壞FOXA2終止密碼子，因此FOXA2 的CDS區(qū)綠色熒光蛋白核酸序列共處一個(gè)基因座，共用一套轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域和抑制區(qū)域，保證EGFP和FOXA2轉(zhuǎn)錄水平同步進(jìn)行。和IRES 序列作為招募核糖體的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site，IRES），幫助EGFP綠色熒光蛋白序列結(jié)合核糖體從而開(kāi)始翻譯進(jìn)程，其自身攜帶的轉(zhuǎn)錄起始和終止密碼子保證蛋白質(zhì)完整結(jié)構(gòu)的正常翻譯。利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因內(nèi)源性表達(dá)示蹤，具有其它外源示蹤體系無(wú)法相比的高效和準(zhǔn)確性，且原理簡(jiǎn)單，技術(shù)通用性強(qiáng)。該類細(xì)胞株在研究中方便直觀，可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)性的檢測(cè)活體細(xì)胞或組織中基因表達(dá)，這是傳統(tǒng)技術(shù)研究方法的空白區(qū)。

4 結(jié)論

本研究利用基因編輯CRISPR/Cas9技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中定點(diǎn)插入綠色熒光蛋白序列實(shí)現(xiàn)對(duì)FOXA2的示蹤。實(shí)驗(yàn)從靶向位點(diǎn)序列的篩選驗(yàn)證、材料構(gòu)建、細(xì)胞株制備及分選鑒定等多方面詳細(xì)描述了研究過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)細(xì)胞模型EGF誘導(dǎo)驗(yàn)證，綠色熒光蛋白表達(dá)水平能夠有效示蹤FOXA2表達(dá)開(kāi)啟和關(guān)閉。

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