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    新一代精準(zhǔn)基因編輯工具CRISPR/Cas9的技術(shù)優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用局限

    2018-06-07 02:30:32吳言郝雅蕎韋璇沈琦柳葉飛王升厚趙洪新
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:核酸酶同源間隔

    吳言 郝雅蕎,2 韋璇,2 沈琦 柳葉飛 王升厚 趙洪新

    (1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018;2. 沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,沈陽(yáng) 110034;3. 沈陽(yáng)師范大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110034)

    近年來(lái),有關(guān)位點(diǎn)特異性核酸酶(Site-specific nuclease,SSN)的基礎(chǔ)理論研究取得了突破性進(jìn)展,使精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用,也取得了令人矚目的成就。位點(diǎn)特異性核酸酶在生物體的基因編輯中提供了十分精準(zhǔn)有效的DNA切割方法[1],其中,鋅指核酸酶(Zine finger endonuclease,ZFN)以及類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALENs)已被廣泛應(yīng)用于基因工程技術(shù)中。這兩種核酸酶的切割原理相同,均是將DNA結(jié)合蛋白與核酸內(nèi)切酶FokI融合完成雙鏈特異性切割,但兩種酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域較為復(fù)雜,操作上技術(shù)難度相對(duì)大,耗時(shí)長(zhǎng)且容易脫靶[2-4],成為制約其發(fā)展的障礙。2013年,Cathomen[5]基于細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)改造而成人工核酸內(nèi)切酶 CRISPR Cas 9,在真核和原核生物中進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯嘗試,獲得巨大成功。這種全新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)以制作簡(jiǎn)單、成本低、作用高效[5]等優(yōu)勢(shì)迅速發(fā)展,并成功應(yīng)用于各種原核生物和真核生物中,包括大腸桿菌[6]、釀酒酵母[7]、鏈霉菌屬[8]、高等植物[9]、家蠶[10]、果蠅[11]和人類(lèi)細(xì)胞[12-14]等。本文從 CRISPR/Cas的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及影響CRISPR/Cas打靶效率的因素等方面進(jìn)行總結(jié),旨為深刻理解其工作原理和在精準(zhǔn)基因編輯中應(yīng)用提供參考。

    1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷史

    1987年,日本科學(xué)家在大腸桿菌K12的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列[15],但由于其功能無(wú)法確定,并未引起科學(xué)家的注意。1995年,西班牙科學(xué)家Mojica等[16]在地中海極嗜鹽菌(Haloferax mediaterranei)和沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haloferax volcanii)中第二次發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。Mojica敏感地意識(shí)到在親緣關(guān)系如此遠(yuǎn)的微生物中存在如此相似的結(jié)構(gòu),可能有著尚未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞功能,引起了許多研究人員的極大關(guān)注。2002年,Coffey等和Jansen等[17-18]把串聯(lián)重復(fù)序列正式命名為成簇間隔規(guī)律短回文重復(fù)序列(Clustered regularly short palindromic repeats,CRISPR),但其生物學(xué)功能仍未闡明。2005年,法國(guó)的Bolotin和Vergnaud、西班牙的Mojica三位科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的3個(gè)實(shí)驗(yàn)室[19-21]幾乎同時(shí)報(bào)道CRISPR中的間隔序列(Spacer)與侵染細(xì)菌的病毒或噬菌體具有很高的同源性,并推測(cè)CRISPR系統(tǒng)可能與細(xì)菌的免疫防御機(jī)制有關(guān)。2007年,Barrangou 等[22]首次發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)能夠通過(guò)CRISPR/Cas系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵,證實(shí)了CRISPR/Cas可以獲得性的提供細(xì)菌對(duì)抗噬菌體的能力。2012年,Sternberg等[23]發(fā)現(xiàn)了II型CRISPR系統(tǒng),該系統(tǒng)中只需要一個(gè)160 kD的Cas9蛋白,同時(shí)利用RNA就可以完成識(shí)別和切割靶向DNA序列。這一防御系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了科研工作者對(duì)于其在基因編輯作用中的研究熱情,利用和優(yōu)化CRISPR系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的探索研究越來(lái)越多,科研成果也層出不窮,精準(zhǔn)編輯功能在細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物中都得到了認(rèn)證,是新一代基因編輯技術(shù)。

    2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

    隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及對(duì)越來(lái)越多微生物基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,人們發(fā)現(xiàn)在已知物種中有90%的古細(xì)菌和40%的細(xì)菌的基因組中含有CRISPR位點(diǎn),而且絕大多數(shù)的細(xì)菌和古細(xì)菌中至少含有一個(gè)CRISPR基因座,極少數(shù)的古細(xì)菌中含有上百個(gè)CRISPR基因座,說(shuō)明了CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌免疫防御機(jī)制是十分重要的[24]。CRISPR/Cas基因座由3個(gè)部分組成,5'端為tracrRNA基因,中間是Cas家族蛋白,3'端為CRISPR基因座,主要由一個(gè)前導(dǎo)序列、23-50 bp的重復(fù)序列和間隔序列串聯(lián)組成,間隔序列由17-84 bp組成,平均長(zhǎng)度約為36 bp。

    Cas蛋白來(lái)自于細(xì)菌具有切割DNA的活性蛋白,除了探究已知的細(xì)菌Cas蛋白差異之外,環(huán)境中存在著很多不為人知或不可培養(yǎng)的微生物種類(lèi),研究人員從土壤,地下水,酸性礦泉水等富含微生物的環(huán)境中取材,將這些微生物的宏基因組信息與CRISPR和Cas1序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)了兩類(lèi)新型的CRISPR-Cas系統(tǒng),將其命名為CRISPR-CasX和CRISPR-CasY,其中CasX蛋白約有980個(gè)氨基酸,CasX蛋白約有1 200個(gè)氨基酸[25]??梢?jiàn)CRISPRCas系統(tǒng)在微生物領(lǐng)域存在的普遍性,具有巨大的基因編輯潛能。

    CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas基因進(jìn)化速度最快,根據(jù)單亞基和多亞基的crRNA效應(yīng)復(fù)合物定義可以將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類(lèi):ClassI和ClassII。ClassI包 括 3個(gè) 亞 型 :TypeI、TypeIII和 TypeIV,ClassII包括兩個(gè)亞型:TypeII和 TypeV[26]。研究表明,ClassII效應(yīng)蛋白Cpf1是一類(lèi)新型的CRISPR-Cas DNA核酸內(nèi)切酶,Cpf1只包含RuvC結(jié)合結(jié)構(gòu)域但不包含HNH結(jié)合結(jié)構(gòu)域[27]。Cpf1可以介導(dǎo)基因組編輯的翻譯后調(diào)節(jié),Cas9和Cpf1的gRNA序列有明顯差異,研究人員設(shè)計(jì)同時(shí)帶有Cpf1的5'-支架序列和Cas9的3'-端序列融合版的引導(dǎo)RNA(fgRNA),fgRNA能夠通用于Cpf1和Cas9兩種類(lèi)型的核酸酶[28]。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)具有基因編輯潛力的 C2c2位于Leptotrichia shahii中ClassII系統(tǒng)的TypeVI上。研究表明C2c2能夠調(diào)控RNA指導(dǎo)的單鏈RNA的斷裂,深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)了C2c2是RNA指導(dǎo)的ssRNA發(fā)生斷裂效應(yīng)物。Zhang等[30]證明了來(lái)自化膿鏈球菌的Cas9酶(SpCas9)和來(lái)自金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶(SaCas9)具有相當(dāng)?shù)腄NA靶向精確度。這些高效Cas9蛋白的發(fā)現(xiàn),對(duì)靶向基因表達(dá)調(diào)控提供了更加高效的基因編輯方法。

    3 II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理

    II型CRISPR/Cas系統(tǒng)行使功能主要分為3個(gè)階段(圖1):即新間隔序列的獲取、CRISPR位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄與加工、CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外源DNA的降解。

    第一階段新間隔序列(Spacer)的獲取可分為3個(gè)過(guò)程,當(dāng)噬菌體首次侵染攜有CRISPR系統(tǒng)的細(xì)菌中時(shí),宿主首先掃描并識(shí)別入侵核酸的PAM序列,將臨近PAM序列的外源DNA作為候選的原間隔序列(Protospacer)。一般來(lái)說(shuō),臨近間隔序列的幾個(gè)堿基比較保守,被稱(chēng)為(Protospacer adjacent motifs,PAM)序列,通常為NGG[31];接著在Cas1和Cas2等蛋白質(zhì)的作用下,將入侵DNA切割成長(zhǎng)度約為48 bp的核酸片段,最后通過(guò)相關(guān)蛋白質(zhì)的作用,將其中一個(gè)核酸片段整合到前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間,形成新的間隔序列,與這個(gè)序列同源的病毒DNA稱(chēng)為原間隔序列。

    第二階段,當(dāng)相同的外源DNA再次侵入時(shí),CRISPR基因座首先轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)的前體CRISPR RNA(pre-crRNA),然后在RNaseⅢ的參與下被切割為長(zhǎng)度不等的核酸小片段,即包含一段間隔序列和部分重復(fù)序列的成熟crRNA[32]。crRNA與反轉(zhuǎn)錄激活RNA(tracrRNA)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與Cas9蛋白形成靶向復(fù)合物crRNP,其在降解外源DNA的階段起到重要作用[13,33-34]。

    第三階段是對(duì)外源DNA的干擾。復(fù)合體crRNP通過(guò)間隔序列尋找到與外源DNA互補(bǔ)的靶序列,此時(shí)Cas9起到切割雙鏈DNA的作用。在II型CRISPR系統(tǒng)中,Cas9蛋白的HNH與RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域能夠分別切割間隔序列的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈,導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂(Double strand breaks,DSBs)被降解,從而抵御了外源DNA的入侵[35]。

    圖1 II型CRISPR-Cas9系統(tǒng)抵御外源噬菌體的獲得性免疫機(jī)制

    4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

    近年來(lái),有關(guān)利用CRISPR/Cas9進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯的應(yīng)用研究發(fā)展十分迅速,已在微生物、植物、動(dòng)物及癌癥基因治療等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,與以前的基因編輯方法相比,展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

    4.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在生物育種中的應(yīng)用

    在微生物學(xué)研究領(lǐng)域,應(yīng)用該技術(shù)在粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)[36]中將clr-2啟動(dòng)子替換為β微管蛋白啟動(dòng)子增強(qiáng)了纖維素酶的表達(dá);Fuller等[37]在煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)中高效靶標(biāo)酮化合物合酶基因,并進(jìn)一步驗(yàn)證了組成型表達(dá)的Cas9核酸酶本身對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)和毒力沒(méi)有危害作用;Wu等[38]成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)在產(chǎn)氣腸桿菌中敲除NADH脫氫酶基因簇nuoC/D和nuoC/D/E基因,得到了雙敲除和三敲除菌株,在搖瓶水平和發(fā)酵罐水平表征菌株,結(jié)果表明在厭氧發(fā)酵罐中氫氣的產(chǎn)量是原始菌株的1.95倍,產(chǎn)氫量得到了很大的提高,為生物制氫提供了新的思路。

    在植物學(xué)研究領(lǐng)域,F(xiàn)eng等[39]將玉米的標(biāo)記基因Zmzb7進(jìn)行改造優(yōu)化產(chǎn)量,結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在玉米的常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)域都可以進(jìn)行高效的基因編輯;Zhang等[40]通過(guò)CRISPR/Cas9瞬時(shí)表達(dá)獲得了初代非轉(zhuǎn)基因純合子小麥突變株;Tian等[41]成功敲除了西瓜中的八氫番茄紅素脫氫酶,結(jié)果顯示CRISPR/Cas9系統(tǒng)在西瓜中的基因編輯效率達(dá)到100%。這些研究表明CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)為植物種子改良提供了新路徑。

    在動(dòng)物學(xué)研究領(lǐng)域,利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功對(duì)綿羊[42]、兔子[43]等中小型哺乳類(lèi)動(dòng)物進(jìn)行了基因編輯,這些研究成果為以中小型動(dòng)物模型,探究人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制提供參考。為了獲得患有蕾特氏癥的動(dòng)物模型,科學(xué)家將恒河猴(Macaca mulatta)和食蟹猴(Macaca fascicularis)的MESP2基因成功敲除,為人類(lèi)研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)P停?4]。

    4.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因治療中的應(yīng)用

    基因治療是治療病毒性疾病的熱點(diǎn),許多癌癥都是由病毒引起,如肝癌由乙肝病毒引起,宮頸癌由人乳頭瘤病毒引起,艾滋病因感染HIV-1病毒引起等。CRISPR/Cas9來(lái)源于細(xì)菌自身的防御系統(tǒng)[45],用該系統(tǒng)抵御并清除外來(lái)病毒感染抑制病毒生長(zhǎng)甚至可治愈病癥。Khalili等[46]發(fā)現(xiàn)Cas9/LTR-gRNA在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能夠在HIV-1病毒整合前明顯阻止其感染細(xì)胞。該項(xiàng)技術(shù)對(duì)于治愈病毒感染的疾病有著重要的指導(dǎo)意義。Maddalo等[47]運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在小鼠體內(nèi)敲除了EML4-ALK融合基因,對(duì)于晚期非小細(xì)胞肺癌臨床治療提供了新的方向。Xie等[48]敲除了血紅蛋白β(HBB)基因?qū)θ祟?lèi)β-地中海貧血癥的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了探究。值得一提的是,Rong等[49]證明Cas9切口酶可以精確靶標(biāo)人體胚胎干細(xì)胞中的長(zhǎng)鏈DNA模板,其編輯效率大約在5%。這預(yù)示著該技術(shù)在不久的將來(lái)會(huì)對(duì)優(yōu)化人類(lèi)受精卵起到深遠(yuǎn)的影響。

    表1例舉了部分已成功利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因編輯的實(shí)例。從這些例子及研究者的文獻(xiàn)研究報(bào)告中可以看出,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)不僅設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、使用范圍廣,而且操作步驟簡(jiǎn)潔、實(shí)驗(yàn)周期短、驗(yàn)證過(guò)程容易,具有十分廣闊的應(yīng)用前景。作為新一代的基因編輯工具,在解析基因功能,基因新性功能的探索,疾病的基因治療,生物基因改造等方面是強(qiáng)有力的方法,是探索生命的奧秘強(qiáng)有力的分子工具。

    表1 部分已經(jīng)報(bào)道成功利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)基因組編輯的實(shí)例

    5 CRISPR/Cas9編輯技術(shù)的應(yīng)用局限

    CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種方便快捷的基因改造方法,其通過(guò)sgRNA中的N20序列尋找并識(shí)別靶位點(diǎn),如果需要進(jìn)行多位點(diǎn)修飾,可以設(shè)計(jì)多條sgRNA[51-53]。但是最新的研究表明sgRNA的錯(cuò)配為5個(gè)堿基時(shí),切割仍能夠發(fā)生,這就導(dǎo)致了CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在較高的脫靶效應(yīng)[54-55]。為了降低CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng),研究人員對(duì)影響CRISPR/Cas9打靶效率的因素進(jìn)行了深入研究并提出了一系列解決方法。

    5.1 影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的因素及解決方法

    sgRNA結(jié)構(gòu)和組成能夠引起脫靶效應(yīng)[56]。研究表明增加[57]或減少[58]2-3個(gè)核苷酸的sgRNA能夠減少錯(cuò)配率從而增加靶序列的專(zhuān)一性。John等[59]創(chuàng)造了新的sgRNA設(shè)計(jì)規(guī)則并建立了人體和小鼠的全基因庫(kù),用基因庫(kù)設(shè)計(jì)出的sgRNA能夠有效減少CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效率。

    Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)打靶效率也有著重要的影響。野生型Cas9蛋白具有切割雙鏈DNA,的活性,形成雙鏈斷裂(Double-strand Breaks,DSBs)從而增加脫靶效應(yīng)的幾率。Frock等[60]將Cas9蛋白改造為Cas9 nickase(nCas9),nCas9能夠使Cas9蛋白的HNH或RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域失活而形成單鏈斷裂(Single-strand Breaks,SSBs),單鏈缺口會(huì)通過(guò)高保真的堿基切除修復(fù)方式進(jìn)行修復(fù)以減少脫靶效應(yīng);Qi等[61]把 Cas9 蛋白改造為 Dead Cas9(dCas9)(圖2-A),dCas9能夠使HNH和RuvC兩個(gè)活性位點(diǎn)均失活,將dCas9與sgRNA在細(xì)胞中共表達(dá),sgRNA介導(dǎo)dCas9與DNA結(jié)合可以抑制基因的起始轉(zhuǎn)錄從而減少脫靶效應(yīng)。科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)將 dCas9 與 FokI核酸酶結(jié)合形成融合蛋白(FokI-dCas9)(圖2-B),可以增加CRISPR/Cas9的靶專(zhuān)一性,通過(guò)一對(duì)sgRNA和dCas9s識(shí)別靶序列,此時(shí)FokI二聚體切割DNA,這種方法雖然能降低脫靶效應(yīng),但同時(shí)也會(huì)降低其打靶活力,并且對(duì)于FokI二聚體來(lái)說(shuō)N20的長(zhǎng)度對(duì)其活力有著十分重要的影響,因此限制了基因組中潛在的靶序列數(shù)量[62-63]。Slaymaker等[64]采用有針對(duì)性的深測(cè)序和無(wú)偏全基因組脫靶效應(yīng)分析評(píng)估Cas9的切割效率,證明了增強(qiáng)型化膿鏈球桿菌Cas9突變體(eSpCas9)能夠減弱脫靶效應(yīng)并且更加精確地進(jìn)行切割。

    此外,PAM序列的長(zhǎng)度也是解決脫靶效應(yīng)的策略之一。金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋 白(SaCas9) 識(shí) 別 的 PAM 區(qū) 為的 NNGRRT(NNGAAT、NNGAGT、NNGGAT和NNGGGT),嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋 白(StCas9) 的PAM序 列 為NGGNG和NNAGAAW,腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)Cas9蛋白(NmCas9)的PAM序列為NNNNGATT,實(shí)驗(yàn)表明這些較長(zhǎng)的PAM序列能夠有效地減少脫靶效應(yīng)[65-67]。這表明更長(zhǎng)的PAM序列在全基因組中,特異性更高,潛在的脫靶位點(diǎn)少,為進(jìn)一步增強(qiáng)靶序列的專(zhuān)一性創(chuàng)造了條件。

    圖2 CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯機(jī)制

    5.2 同源重組率對(duì)CRISPR/Cas9打靶效應(yīng)的影響

    當(dāng)Cas9蛋白切割雙鏈DNA形成雙鏈斷裂后,細(xì)胞會(huì)采取非同源末端連接機(jī)制(Nonhomologous end joining,NHEJ) 或 同 源 重 組(Homologous recombination,HR)修復(fù)受損的細(xì)胞,但是非同源末端連接修復(fù)機(jī)制會(huì)引發(fā)由堿基的插入或刪除從而導(dǎo)致基因突變,同源重組修復(fù)機(jī)制能夠精確的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù),增強(qiáng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性。在真核生物中研究人員發(fā)現(xiàn)KU70、KU80和DNA連接酶IV是NHEJ通路中的關(guān)鍵因子。德國(guó)MDC研究所的研究人員使用DNA連接酶IV抑制劑SCR7進(jìn)行了基因沉默,并表達(dá)了腺病毒蛋白E1B55K和E4orf6,抑制KU70和DNA連接酶IV能夠?qū)⑼炊ㄏ蛐迯?fù)(Homology directed repair,HDR)效率提高4-5倍。在人類(lèi)和小鼠細(xì)胞系中腺病毒蛋白與Cas9系統(tǒng)共表達(dá)時(shí),HDR效率提高了8倍,大幅度抑制了NHEJ活性[68]。Whitehead研究所的研究人員在對(duì)受精卵進(jìn)行基因編輯時(shí)添加了SCR7抑制劑,這項(xiàng)研究將CRISPR/Cas的HDR率提高了19倍[69]。另一方面,研究人員還發(fā)現(xiàn)供體DNA的長(zhǎng)度也會(huì)影響同源重組率。Lin等[70]發(fā)現(xiàn)至少需要15 nt的同源臂長(zhǎng)度才能實(shí)現(xiàn)同源重組。而Rong等[71]比較了引入長(zhǎng)度為1 kb的上下游同源臂與引入單側(cè)同源臂在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中的同源重組效率,實(shí)驗(yàn)表明引入標(biāo)靶基因的雙側(cè)通同源臂后的HDR效率更高。

    6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用前景

    特別是近年來(lái)研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行精準(zhǔn)基因編輯,也取得了令人矚目的研究成果,無(wú)數(shù)成功的例子和高水平文章的發(fā)表顯示了其強(qiáng)大應(yīng)用潛力。盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存著如打靶效率低、靶專(zhuān)一性不強(qiáng)等技術(shù)局限,但仍說(shuō)明CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍需完善,有巨大的研究空間需要探索。許多研究人員從CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成結(jié)構(gòu)分析和攻關(guān)嘗試,改良sgRNA的結(jié)構(gòu),增強(qiáng)靶特異性是最直接的手段;也有研究人員致力于探索Cas9的結(jié)構(gòu)及功能,篩選和改造特異性更強(qiáng)的Cas蛋白,來(lái)解決脫靶效應(yīng)問(wèn)題,同時(shí)尋找提高同源重組率的方法對(duì)提高打靶效率也有一定的作用。相信通過(guò)研究人員的努力和嘗試,及隨著生物技術(shù)的發(fā)展,CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用中存在的技術(shù)局限,終將被攻克,CRISPR/Cas新一代基因編輯系統(tǒng)在農(nóng)業(yè),醫(yī)學(xué)及生物等各個(gè)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的應(yīng)用前景,發(fā)揮更重要的作用。

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