CRISPR/Cas9技術(shù)在表觀基因組中應(yīng)用的探討

賀帥 王淑輝 孫秀柱

（西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100）

對生物體基因進行改造是提高動植物遺傳育種效率的有效方式。在基因改造的研究進程中，科研工作者對生物體中基因的修飾和改造研究不斷開拓。1989年，Thomas等［1］利用同源重組（Homologous recombination，HR）技術(shù)實現(xiàn)小鼠的基因打靶；Urnov等［2］于2005年使用鋅指核酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）技術(shù)對T細胞基因組基因編輯；Nakajima等［3］于2010年使用轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator- like effector nucleases，TALENs）技術(shù)靶向切割雙鏈DNA；2012年，隨著成簇規(guī)律間隔短回文重復序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復序列關(guān)聯(lián)蛋白9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas9）的發(fā)現(xiàn)至今，逐漸成為基因編輯研究中最為普遍的工具［4］。相比于HR，ZFN和TALEN技術(shù)基本實現(xiàn)基因的定點編輯，但是，這兩種基因編輯技術(shù)需要組裝識別切割區(qū)域DNA的結(jié)合蛋白體，相比于通過小向?qū)NA（Small guide RNA，sgRNA）與DNA堿基互補配對確定編輯靶向關(guān)系的CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)，難度和門檻要高得多［5］。

CRISPR/Cas9技術(shù)利用一段長度為20 nt左右的sgRNA引導Cas9核酸酶對目標DNA進行切割，引起DNA的修復進而改變目標DNA基序。堿基序列的排布是DNA信息含量豐富度的主要因素，然而基因組的表觀修飾也提升了DNA的信息含量。包括被稱為第5種堿基的5甲基胞嘧啶（5mC），被稱為第6種堿基的5羥甲基胞嘧啶（5hmC），以及5甲酰胞嘧啶（5fC）和5羧基胞嘧啶（5caC）被更多地研究，為探索DNA的結(jié)構(gòu)和功能提供有效的理論基礎(chǔ)［6］。H3、H4組蛋白修飾通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與到基因的表達調(diào)控［7］?？缭竭^去20年的大量研究證據(jù)呈現(xiàn)了豐富的表觀遺傳機制，包括發(fā)現(xiàn)DNA修飾，組蛋白翻譯后修飾（PTM）和非編碼RNA（ncRNA）與表型相關(guān)的大量結(jié)果［8-10］。介導染色質(zhì)結(jié)構(gòu)組織與近2 m長的基因組DNA經(jīng)過壓縮、整合、組裝成5 μm的三維結(jié)構(gòu)體現(xiàn)了表觀基因組的系統(tǒng)性和復雜性［11］。此外，異常染色質(zhì)會引起很多人類疾病，而染色質(zhì)狀態(tài)和基因組的表觀修飾又息息相關(guān)。例如，甲基化結(jié)合蛋白（Methyl CpG binding protein 2，MeCP2）的突變誘發(fā)招募去乙?；割?，導致Rett綜合癥［12］；編碼ATP水解酶亞基突變導致依賴ATP水解酶的染色質(zhì)重塑因子功能障礙，引發(fā)神經(jīng)退變、發(fā)育異常［13］；基因組甲基化、乙?；淖兓c癌細胞的增殖分化相關(guān)［14］；多能干細胞（Pluripotent stem cell，Ps）的潛能和定向分化受到基因組表觀修飾的干預；在體細胞核移植過程中表觀因子的重編程和基因的時序性表達相關(guān)［15］。利用改造后的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對表觀基因組進行研究，從而探討基因組修飾作用，深入了解特定基因位置區(qū)域表觀修飾的功能。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯表觀基因組的技術(shù)基礎(chǔ)

CRISPR/Cas9是一種來自微生物免疫系統(tǒng)的可編程核酸酶［16］。當原型間隔區(qū)相鄰基序（PAM）以及與其互補的目標DNA鏈的sgRNA同時存在時，sgRNA引導Cas9在靶DNA序列上產(chǎn)生位點特異性雙鏈斷裂（Double-strand breaks，DSBs），誘導DNA進行修復，如非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）或同源定向修復（Homologous directed repair，HDR）。通常情況下，HDR需要一個同源模板，對細胞周期的狀態(tài)有特殊要求，因而產(chǎn)生 NHEJ的概率會更大［17］。

在CRISPR/Cas9進入目標DNA后打開雙鏈，野生型Cas9（wt-Cas9）擁有的兩個催化結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC分別對所處單鏈進行切割，產(chǎn)生DSBs［18］。通過滅活wt-Cas9的兩個催化結(jié)構(gòu)域的任意一個形成切割酶Cas9（Nicks Cas9，nCas9），在靶DNA序列上產(chǎn)生單鏈斷裂而不是DSBs［19］。據(jù)報道，與產(chǎn)生DSB的wt-Cas9相比，使用nCas9切割目標DNA具有更低的脫靶率，可能是因為脫靶單個切口快速修復并因此檢測不到［20-21］。如果將Cas9的兩個催化結(jié)構(gòu)域都失去活性，就變成催化失效的Cas9（Dead Cas9，dCas9），應(yīng)用dCas9便可以和表觀遺傳修飾物的融合體共同作用基因組，可以實現(xiàn)改造基因組修飾的目的（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas技術(shù)改造基因組表觀修飾物

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)改造DNA的化學修飾

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變［22］。序列中的CpG二核苷酸（CpG dinucleotide）中的5'C易產(chǎn)生甲基化、羥甲基化等修飾，大量的研究表明這些修飾和基因的表達相關(guān)聯(lián)［23］。利用無切割效應(yīng)的dCas9融合共價修飾組蛋白或化學修飾DNA的酶基因可以對靶序列進行相應(yīng)的修飾。Vojta等［24］報道使用Gly4Ser接頭將dCas和甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）連接質(zhì)粒同靶向目的基因BACH2和IL6ST的sgRNA同轉(zhuǎn)染HEK293細胞系，改變了兩個基因啟動子區(qū)域甲基化程度，基因的表達顯著降低。FMR1基因5'UTR區(qū)CGG擴增突變的高甲基化引起FMR1基因沉默進而導致脆性 X 綜 合 征（Fragile X syndrome，F(xiàn)XS）［25］，Liu等［26］利用dCas9和Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶1基因（Tet methylcytosine dioxygenase 1，Tet1）融合轉(zhuǎn)染FX52 iPSCs細胞系［27］，對FMR基因5'端靶向序列進行去甲基化，為FXS治療奠定可靠基礎(chǔ)。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對染色質(zhì)的表觀修飾

真核生物體內(nèi)DNA的活動都依附于染色質(zhì)，染色質(zhì)元素的包裝狀態(tài)影響基因的復制、轉(zhuǎn)錄等功能。利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以改變?nèi)旧|(zhì)重塑因子結(jié)合位點，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。Ishihara等［28］通過CRISPR/Cas9技術(shù)靶向染色質(zhì)絕緣子結(jié)合位點，消除HOXA基因啟動子區(qū)與增強子區(qū)域之間的絕緣效應(yīng)。在基因轉(zhuǎn)錄過程中，組蛋白的包裝形式直接或間接地影響到基因染色質(zhì)開放情況，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動子或增強子的結(jié)合程度。利用CRISPR/Cas9可以改變?nèi)旧|(zhì)重塑因子與基因組的結(jié)合狀態(tài)來影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。同樣地，基于以非常精確的方式分配染色質(zhì)修飾劑可以使用CRISPR/dCas9系統(tǒng)對組蛋白進行共價修飾［29］，如組蛋白去甲基化酶（HDM）、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT）、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）、組蛋白去乙基化酶（HDAC）、組蛋白泛素連接酶（HUbq）。染色質(zhì)修飾物的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)㈦慕宇^和核定位信號（NLS）與dCas9蛋白結(jié)合，提高染色質(zhì)修飾的精確度和效率［30］。此外CRISPR/Cas系統(tǒng)提供了同時誘導幾種靶向染色質(zhì)修飾的可能性，因為sgRNA分子可以用作支架以招募與各種效應(yīng)結(jié)構(gòu)域連接的不同RNA結(jié)合蛋白，利用系統(tǒng)的正交性可以靶向多個基因座，使用來自不同物種的Cas9核酸酶及其相應(yīng)的gRNA［31］。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對非編碼RNA（Noncoding RNA，ncRNA）的調(diào)控

廣義的表觀遺傳的元素不單指DNA、組蛋白的化學或共價修飾，還包括ncRNA等元素。ncRNA在真核生物基因表達中起到至關(guān)重要的作用，例如，小分子RNA（microRNAs，miRNA）在基因轉(zhuǎn)錄后對mRNA進行調(diào)節(jié)，Danielson［32］和Zhang等［33］利用CRISPR/Cas9敲除miRNA簇引起因器官缺陷導致的胚胎致死；而長鏈非編碼RNA（LongnoncodingRNA，lncRNA）既參與轉(zhuǎn)錄層次的調(diào)節(jié)，也參與轉(zhuǎn)錄后層次的調(diào)節(jié)。因為缺乏開放閱讀框，敲除非編碼基因的最主要的挑戰(zhàn)是由標準CRISPR/Cas系統(tǒng)產(chǎn)生的小的缺失或插入可能不一定導致給定非編碼基因的功能喪失［34］。

Jiang等［35］于2014年報道靶向HeLa細胞中人miRNA-93基因的5'區(qū)域在包含Drosha加工位點和種子序列的目標區(qū)域誘導幾個小的插入缺失。參照智人miRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase；http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkq1027）發(fā)現(xiàn)，即使高特異性敲除目標miRNA，也可能影響miRNA簇中其它miRNA的表達。在進化過程中，miRNA家族由共有相同5'種子區(qū)域［36］，要做到不影響其他同源miRNA的表達的情況下敲除靶向miRNA是困難的［37］。為了克服這一挑戰(zhàn)，通常允許標記基因通過同源重組（HR）整合到基因組中的選擇系統(tǒng)。另外，構(gòu)建雙向引導載體sgRNA在靶向位點同時切割產(chǎn)生大片段刪除。利用這些方法，成功地在各種人類細胞系中 產(chǎn) 生 miR-21，miR-29a，UCA1，lncRNA-21A和AK023948的敲除［38-40］。這些結(jié)果證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人細胞系中敲除ncRNA的可行性。

5 展望

盡管以前表觀遺傳學領(lǐng)域側(cè)重于分析不同細胞類型中的表觀遺傳狀態(tài)以闡明生物學功能，但是對表觀基因組編輯可能會徹底改變表觀遺傳學研究領(lǐng)域。使用dCas9連同具體的修飾因子共轉(zhuǎn)染到活細胞可以實現(xiàn)目的基因的修飾以及染色質(zhì)的修飾改造，更直接地從細胞層面了解其特定功能、從基因?qū)用媪私馄涮囟▍^(qū)域修飾的具體作用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以針對表觀修飾異常的基因組進行“糾錯”，也可以直接靶向產(chǎn)生突變的與染色質(zhì)重塑相關(guān)因子恢復其功能，起到“御防”表觀基因組疾病的作用。此外，在進行堿基序列的編輯時，為符合生物安全要求，通常進行內(nèi)源性基因的改造，然而對于表觀基因組的修飾并沒有特定物種的具體安全規(guī)范。表觀遺傳元素通常與基因的表達相關(guān)聯(lián)，部分增強子的表觀修飾對基因表達程度存在顯著的相關(guān)，基因組同一位置序列可能在基因表達中扮演不同的角色，使用CRISPR/Cas9對特定物種、特定組織、特定基因區(qū)域表觀因子的改造適于探索表觀因子和基因表達的因果關(guān)系，以及染色質(zhì)區(qū)域結(jié)構(gòu)的具體功能。此外，RNA的突變和修飾影響著動植物的生命活動，CRISPR/Cas9技術(shù)對RNA突變和修飾方面的研究將成為一種新的研究方向，便于探索獲得性遺傳、蛋白的翻譯調(diào)控以及RNA的病毒檢測，為探索基因功能、生命科學研究以及醫(yī)療疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

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