基于諾麗葉片愈傷組織的細(xì)胞懸浮系的建立

張正雪 藍(lán)增全 吳田

（1. 西南林業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650224；2. 西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，昆明 650224）

諾麗是一種常綠的熱帶多年生闊葉小喬木或灌木，由英文名Noni翻譯而來，別名海巴戟、諾尼［1］、四季果［2］等，是巴戟天屬茜草科植物，拉丁名為Morinda citrifoliaL，發(fā)源于南太平洋島嶼［3］，因其對溫度的特殊需求，生境較為苛刻，故而在全球的分布較為狹窄。主要分布于大溪地、夏威夷、印度尼西亞、菲律賓、以及我國的海南島、西沙群島［4］和臺灣島、云南西雙版納［5］等。諾麗葉含有很多生化成分，有比較強(qiáng)的抗氧化能力［6］，主要是抗氧化劑和生物類黃酮，如萜烯類化合物［7-11］和黃酮甙類等［7］。2009年張偉敏等［12］實驗證明了諾麗葉片具有降血壓血糖和抗氧化的能力。

近年來，研究者們通過建立藏紅花的細(xì)胞懸浮系獲得了藏紅花素［13］，通過建立喜樹［14］和新疆雪蓮［15］等植物的細(xì)胞懸浮系，也分別獲得了喜樹堿［16］和黃酮［15］。國內(nèi)目前對諾麗的使用主要是諾麗果，而對諾麗葉片的使用幾乎沒有，實際上葉片中富含一些抗氧化劑和生物類黃酮類物質(zhì)。因此，在本課題組前期對諾麗的不同外植體（根、莖、葉）進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)［17-19］的基礎(chǔ)上，本實驗擬通過探索MS液體培養(yǎng)基的激素組成、初始接種量以及在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中pH值的變化、懸浮細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞存活率等參數(shù)，確定繼代周期，完成諾麗葉片細(xì)胞懸浮體系的建立，以為后續(xù)諾麗葉片中次生代謝物的誘導(dǎo)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用材料為淡黃色、質(zhì)地疏松的愈傷組織。參照前人諾麗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的方法，以實驗室培養(yǎng)的諾麗無菌苗葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)和繼代的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS + 0.1 mg/L 6-BA（6-芐氨基嘌呤）+ 2.0 mg/L 2，4-D（2，4氯化苯氧乙酸）；愈傷組織繼代培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg/L NAA（a-萘乙酸）+0.1 mg/L KT（激動素）［19］。

1.2 方法

1.2.1 諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基 以愈傷組織誘導(dǎo)和繼代的培養(yǎng)基配方為參考，以MS為基本培養(yǎng)基，每1 000 mL培養(yǎng)基附加激素（激素組合和濃度見表1）、蔗糖3%、pH 5.8、分裝、121℃下滅菌20 min。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每2 d取兩瓶懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液測定一次細(xì)胞鮮重，生長量以濕細(xì)胞鮮重計。取2 mL 培養(yǎng)液，4℃下5 000 r/min離心5 min，棄去上清液，稱量底部沉淀細(xì)胞鮮重。細(xì)胞生長速度以比生長速率計，比生長速率（d-1）=（培養(yǎng)結(jié)束時細(xì)胞鮮重-接種細(xì)胞鮮重）/接種細(xì)胞鮮重/培養(yǎng)天數(shù)。

1.2.2 諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程 選取繼代培養(yǎng)后淡黃色、分散性好、生長良好的愈傷組織，在超凈工作臺上用鑷子將其夾碎，轉(zhuǎn)接于MS液體培養(yǎng)基中，每250 mL的培養(yǎng)瓶中加入液體培養(yǎng)基50 mL。實驗設(shè)計1.5 g、2.5 g、3 g、4 g這4個不同初始接種量，接種完成后，置于轉(zhuǎn)速110 r/min、溫度（25±2）℃的搖床上進(jìn)行暗培養(yǎng)。分別觀察愈傷組織在液體中的生長變化狀況，進(jìn)行統(tǒng)計、比較、篩選。每隔7 d繼代培養(yǎng)1次，繼代時除去大塊愈傷組織，培養(yǎng)液按照與新鮮培養(yǎng)液1：2的比例進(jìn)行混合再培養(yǎng)。篩選分散度好、較均勻、生長快的細(xì)胞作為母細(xì)胞，多次繼代后得到性能良好、穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系。

表1 不同激素組合和濃度培養(yǎng)基

1.2.3 培養(yǎng)液pH值的測定 每2 d測定一次培養(yǎng)液的pH值，用PHS-3CW型數(shù)顯酸度計測定培養(yǎng)液pH。每次使用前，先用預(yù)先配制好的標(biāo)準(zhǔn)試劑校準(zhǔn)，以確保儀器測量值的準(zhǔn)確性。3瓶分別測量，測量數(shù)據(jù)取平均值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，繪制諾麗葉片細(xì)胞懸浮液pH變化曲線。

1.2.4 細(xì)胞懸浮生長曲線的測定 測定pH值的同時用血球計數(shù)板法檢測懸浮培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)，記錄其生長情況。從初次培養(yǎng)時開始，在其培養(yǎng)過程中，每2 d取3瓶懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液，先用0.25% 的果膠酶對細(xì)胞團(tuán)處理，讓懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞呈游離單細(xì)胞，便于細(xì)胞計數(shù)，再進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的多次檢測，取平均值作為最優(yōu)數(shù)據(jù)記錄。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，懸浮細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制諾麗葉片懸浮細(xì)胞生長曲線。

1.2.5 TTC法測定細(xì)胞活力 用TTC法［20］測定細(xì)胞活力，以掌握細(xì)胞各時期的活力以便于后續(xù)實驗的開展和對懸浮系的利用。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)的觀察 每2 d進(jìn)行一次細(xì)胞生長與變化情況的觀察。采用觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞的倒置顯微鏡（40×）進(jìn)行觀察，拍照記錄細(xì)胞的生長變化情況。

1.2.7 懸浮細(xì)胞存活率的測定 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，先配制0.1% 酚藏花紅溶液。檢查時將經(jīng)0.25%的果膠酶處理過的懸浮細(xì)胞取一滴放在載玻片上，滴一滴0.1% 酚藏花紅溶液，蓋上蓋玻片，在低倍鏡下，隨機(jī)計數(shù)上、下、左、右、中5個視野內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)和被染成紅色的細(xì)胞數(shù)，紅色細(xì)胞為死細(xì)胞，按以下公式計算細(xì)胞存活率：懸浮細(xì)胞存活率（%）=［（細(xì)胞總數(shù)-死亡細(xì)胞數(shù)）/懸浮細(xì)胞總數(shù)］×100%。

1.2.8 細(xì)胞平板培養(yǎng) 為了檢測懸浮細(xì)胞的活性，用培養(yǎng)皿分裝固體MS培養(yǎng)基，將穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液涂布在該培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，涂布后密封培養(yǎng)皿并將其置于溫度（25±2）℃條件下暗培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 諾麗葉片懸浮細(xì)胞在不同液體培養(yǎng)基中的生長情況

經(jīng)測定、計算可得到諾麗葉片懸浮細(xì)胞在3種液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長速度（圖1）。諾麗葉片懸浮細(xì)胞在3種液體培養(yǎng)基的細(xì)胞生長速度有所不同，且差異顯著，懸浮細(xì)胞在MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中比生長速率顯著高于其它兩種培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/LNAA中細(xì)胞比生長速率為0.0398/d；在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT 中懸浮細(xì)胞比生長速率為0.0753/d；在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA中比生長速率僅有0.026/d。因此，選定MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT作為諾麗葉片懸浮培養(yǎng)的MS液體培養(yǎng)基。

圖1 3種不同液體培養(yǎng)基中諾麗葉片懸浮細(xì)胞的比生長速率

2.2 不同初始接種量對諾麗葉片懸浮細(xì)胞生長的影響

實驗設(shè)計4個初始接種量，不同初始接種量下細(xì)胞生長速率不同（圖2）：在液體培養(yǎng)基中，初始接種量為1.5-3 g/50 mL，隨著接種量的增加，懸浮細(xì)胞的比生長速率成遞增趨勢，繼續(xù)增加接種量至4 g/50 mL細(xì)胞的比生長速率開始下降，同時褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，可能是因為接種量的增加，培養(yǎng)到中后期時培養(yǎng)基里的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，造成培養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)缺乏而死亡。因此，選定3 g/50 mL為適宜初始接種量。

圖2 不同初始接種量下細(xì)胞的生長情況

2.3 培養(yǎng)液pH值的測定

pH是影響細(xì)胞生長的因子，培養(yǎng)基的pH可以改變營養(yǎng)元素的離子化狀態(tài)，進(jìn)而影響細(xì)胞新陳代謝活性。諾麗葉片細(xì)胞懸浮液的pH變化呈先下降后上升逐漸平穩(wěn)下降趨勢（圖3），由初始的pH 5.8在第4天下降到最低4.21，后逐漸升高，到14-16 d恢復(fù)到5.8，之后逐漸趨于平穩(wěn)。前期的pH值下降與后期的pH值上升，這可能與細(xì)胞培養(yǎng)液中各種離子的不等量吸收以及細(xì)胞在新陳代謝中釋放的物質(zhì)酸堿性有關(guān)。根據(jù)培養(yǎng)液pH值的這種變化情況，可初步確定諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的最佳繼代周期為22 d左右。

圖3 諾麗葉片懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液pH值變化情況

2.4 諾麗葉片懸浮細(xì)胞生長曲線

在附加2 .0 mg/L NAA和0.2 mg/L KT的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。初始接種量為3 g/50 mL。通過定期測定細(xì)胞數(shù)量，可以了解細(xì)胞的生長狀況（圖4）：諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長曲線成“S”型，接種后6 d為滯后期，這可能是細(xì)胞尚未適應(yīng)新的生長環(huán)境；隨后的6-14 d進(jìn)入對數(shù)生長期，此時細(xì)胞細(xì)胞分裂活躍，生長加快，增長迅速；之后在14-26 d時進(jìn)入直線生長期，是細(xì)胞增殖、生長和發(fā)育最明顯的時期，細(xì)胞數(shù)量在26 d時達(dá)到最大值11.76×105個/mL。26 d后細(xì)胞數(shù)量下降，進(jìn)入較長的生長靜止期（26-30 d）。因此，結(jié)合與諾麗葉片細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)的過程中的pH值的變化情況，可確定最佳繼代培養(yǎng)時間是22-26 d。

圖4 諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長曲線圖

2.5 諾麗葉片懸浮細(xì)胞的活力曲線

對諾麗懸浮細(xì)胞活力曲線進(jìn)行測定，細(xì)胞新陳代謝越旺盛其OD值越高（圖5），且細(xì)胞呈深紅色。以葉片為外植體的懸浮細(xì)胞，剛接入培養(yǎng)基諾麗細(xì)胞活力OD值在0.9，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加OD值在21 d達(dá)到1.8，隨后平穩(wěn)。

綜上，細(xì)胞懸浮生長曲線、懸浮液pH值、細(xì)胞活力曲線之間存在一定對應(yīng)關(guān)系。諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液細(xì)胞生長曲線在14-22 d進(jìn)入直線生長期，而此時懸浮液的pH值在5.67-5.97，用細(xì)胞存活力在第18 d 細(xì)胞活力值最大OD485=1.8，對應(yīng)了細(xì)胞生長曲線與pH，此時期細(xì)胞懸浮液生長狀態(tài)較好。

圖5 諾麗葉片懸浮細(xì)胞活力測定

2.6 諾麗葉片懸浮細(xì)胞形態(tài)觀察

懸浮細(xì)胞在倒置顯微鏡的觀察下，細(xì)胞不同時期的生長變化情況不同（圖6）。初代細(xì)胞懸浮液中，大量細(xì)胞聚集，形成細(xì)胞團(tuán)（圖6-A）；第3代開始出現(xiàn)明顯變化，形成桿狀細(xì)胞（圖6-B）；第5代時有少量圓細(xì)胞形成，大量細(xì)胞有形成圓細(xì)胞的趨勢（圖6-C）；隨著繼代次數(shù)的增加逐漸呈20-30個左右的小細(xì)胞聚集體，第6代后呈較規(guī)則的圓球體，細(xì)胞核明顯（圖6-D）。說明隨著繼代次數(shù)的增加，細(xì)胞懸浮體系逐步趨于穩(wěn)定。

圖6 諾麗葉片懸浮細(xì)胞40×顯微鏡下形態(tài)變化圖

2.7 懸浮細(xì)胞存活率的測定

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在繼代5-8次以后，形成穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)液，將培養(yǎng)結(jié)束的穩(wěn)定懸浮培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞存活力測定，染色后活細(xì)胞無色，死亡細(xì)胞呈紅色（圖7），以葉片為外植體的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)存活力達(dá)77.9%。

圖7 諾麗懸浮細(xì)胞染色后活細(xì)胞和死細(xì)胞

2.8 細(xì)胞平板培養(yǎng)

細(xì)胞平板培養(yǎng)中，暗培養(yǎng)下15 d左右開始形成愈傷組織（圖8-A），23 d左右大量增殖（圖8-B），兩實驗表明諾麗葉片懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞存活率高。

圖8 平板培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織

3 討論

通過對實驗的觀察記錄分析得知，雖然不同的激素組合對懸浮細(xì)胞比生長速率的影響不同，但每個組合的培養(yǎng)基中細(xì)胞都在生長。本實驗中，NAA和KT搭配對細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果比較好，而2，4-D和6-BA 組合的培養(yǎng)基中細(xì)胞的比生長速率不太理想。前人研究表明，在適宜濃度下2，4-D和6-BA對懸浮系中細(xì)胞增殖大多有促進(jìn)作用，前人在西洋參細(xì)胞懸浮系的液體培養(yǎng)基中使用了1.0 mg/L 2，4-D［21］，在黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中使用了0.2 mg/L 2，4-D［22］。筆者認(rèn)為在諾麗葉片愈傷組織細(xì)胞懸浮系中，在確定NAA和KT對細(xì)胞增殖起積極作用的同時，合適濃度的2，4-D可能也對其起促進(jìn)作用。

細(xì)胞懸浮系的培養(yǎng)具有獲得次生代謝物的同時不傷害植物本身的優(yōu)點，本研究對諾麗葉片進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究，獲得了穩(wěn)定諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，穩(wěn)定的諾麗細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液可再生愈傷組織及外植體，以及建立諾麗細(xì)胞懸浮培養(yǎng)動力學(xué)模型，同時鑒于諾麗葉片本身所含有的生物類黃酮和蒽醌類物質(zhì)的藥用價值［12］，后續(xù)將通過諾麗葉片細(xì)胞懸浮系對其二者進(jìn)行誘導(dǎo)，研究者使用TDZ（噻苯隆）在銀杏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)細(xì)胞二萜類化合物的產(chǎn)生［23］，在黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中加入2，4-D和6-BA時，黃芩苷的積累量最大［22］。本課題組在后續(xù)的實驗中，擬在懸浮系中加入2，4-D，6-BA 和TDZ，并對濃度梯度進(jìn)行探索，對諾麗葉片中的萜烯類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)和富集。

4 結(jié)論

實驗以諾麗葉片為外植體，基于課題組諾麗葉片愈傷組織誘導(dǎo)方法建立了穩(wěn)定的諾麗葉片細(xì)胞懸浮體系。實驗中諾麗葉片細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。在該培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時懸浮細(xì)胞比生長速率為0.0753 d-1；實驗中最佳接種量為60 g/L，此時細(xì)胞生長速率達(dá)到最大；對細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中各個指標(biāo)的監(jiān)測結(jié)果表明最佳繼代周期為22-26 d；實驗最終形成的穩(wěn)定細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液的細(xì)胞存活率為77.9%。

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