抗枇杷根腐病病菌的內(nèi)生木霉菌株篩選

魯海菊， 江 濤， 胡金碧， 毛春誠(chéng)， 王傳銘

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南蒙自 661199)

自1998年臺(tái)灣地區(qū)首次報(bào)道枇杷根腐病以來(lái)，福建、云南等地區(qū)也相繼發(fā)生枇杷根腐病，其田間癥狀初期表現(xiàn)出樹(shù)勢(shì)衰退，葉片變黃脫落，下大雨時(shí)，植株發(fā)病較快，只留下褐色干枯的葉片掛在死樹(shù)枝上，莖基部皮層變暗色，流膠。發(fā)病中期莖呈暗褐色，基部腐爛，韌皮部呈魚鱗狀，地上部維管組織呈紅褐色。病株根環(huán)腐，不長(zhǎng)新根，有白色菌絲。后期植株萎蔫、樹(shù)皮脫落、最后整株枯死。云南、臺(tái)灣、福建等3個(gè)枇杷栽培區(qū)，其根腐病癥狀相似，但病原菌各不相同，分別由小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)[1]、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)[2]、帚梗柱孢屬(Cylindrocladiumsp.)真菌[3]引起。經(jīng)多次分離，云南地區(qū)未發(fā)現(xiàn)寄生疫霉和帚梗柱孢屬真菌2種病原菌侵染枇杷引起根腐病的情況。枇杷根腐病屬于土傳病害，高溫高濕有利于此病發(fā)生，發(fā)病高峰期在7、8月份，從出現(xiàn)癥狀到整株死亡，快的需要1個(gè)月，慢的也不超過(guò)2年，發(fā)病率高達(dá)40%及以上，且有逐漸加重之勢(shì)，每年損失數(shù)億元。云南地區(qū)的枇杷特色產(chǎn)業(yè)正面臨著毀滅性災(zāi)難，急需高效的防治方法。

近年來(lái)，當(dāng)?shù)刂脖９ぷ髡呗?lián)合紅河學(xué)院積極探索防治枇杷根腐病的方法，但效果甚微。目前，除了氟菌·霜霉威(銀法利)對(duì)枇杷根腐病有一定的控制效果之外，其他農(nóng)藥都沒(méi)有控制效果。另外，由于此病發(fā)展迅速，往往來(lái)不及防治，植株就已死亡；加之氟菌·霜霉威價(jià)格較高(凈含量為25 mL的1袋銀法利市場(chǎng)售價(jià)為100元)，沒(méi)有得到有效推廣應(yīng)用?？梢?jiàn)，化學(xué)防治未能有效控制枇杷根腐病。另外，化學(xué)防治土傳病害存在施藥困難、成本高、容易引起殘留及環(huán)境污染等問(wèn)題。枇杷抗病育種工作目前相對(duì)滯后，在枇杷中尋找抗枇杷根腐病的基因，成功培育出抗枇杷根腐病的抗性品種，在短期內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)。目前看來(lái)，生物防治是一種經(jīng)濟(jì)有效的控制枇杷根腐病的方法。

魯海菊等報(bào)道，內(nèi)生木霉P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病病菌(P.microspora)有強(qiáng)烈的抑制作用[4]，抗菌譜廣[5]，對(duì)枇杷內(nèi)生真菌[6]及其根際土壤真菌[7]均有極強(qiáng)的抑制作用。P3.9菌株能成功定殖于枇杷主干及其根際土壤中，盆栽防治效果高達(dá)80%，且具有固氮、抗化學(xué)農(nóng)藥、降解難溶磷酸鹽、降解纖維素等多種功能(未發(fā)表)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。雖然目前木霉P3.9菌株是防治枇杷根腐病良好的菌種資源，但也存在菌種衰退的風(fēng)險(xiǎn)。因此，筆者從黃瓜及枇杷中分離得到12株內(nèi)生木霉，擬測(cè)定其對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用，篩選出更多能防治枇杷根腐病的優(yōu)良木霉菌株，以期為此病害的綠色防控提供菌種資源及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 12株內(nèi)生木霉(Trichodermaspp.)菌株，分別分離自黃瓜的莖(菌株J1、J2、J3、J4、J5、JD3)、根(菌株GD3、GD5、GM6)、葉(菌株Y2)及枇杷主干韌皮部(菌株P(guān)Z1、P3.9)。枇杷根腐病病菌(P.microspora)，分離自枇杷根腐病病株根莖韌皮部。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：200.0 g馬鈴薯、18.0 g葡萄糖、13.5 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水。PD培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、18 g葡萄糖、1 000 mL蒸餾水。將上述培養(yǎng)基配好后均在121 ℃高壓滅菌30 min。材料均購(gòu)自云南省蒙自市農(nóng)貿(mào)中心及云南科儀化玻有限公司，試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)峙培養(yǎng) 將枇杷根腐病病菌和各供試木霉菌株在PDA平板培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，采用對(duì)峙培養(yǎng)法[8]，在培養(yǎng)基同一半徑周圍，用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，將木霉與病菌兩兩組合，同時(shí)接種于無(wú)菌PDA平板(直徑 90 mm)中，2個(gè)接種點(diǎn)相距45 mm，以不接種木霉菌作為對(duì)照，設(shè)3次重復(fù)，在28 ℃恒溫培養(yǎng)，第7天測(cè)定病菌的菌落直徑，計(jì)算其生長(zhǎng)抑制率。抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%，其中dCK表示對(duì)照菌落直徑，dB表示處理菌落直徑。

1.2.2 拮抗等級(jí)測(cè)定 拮抗等級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照張瑾等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ：木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積的100%；Ⅱ：3/4<木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積<100%；Ⅲ：2/3<木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積≤3/4；Ⅳ：木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積≤2/3[9]。

1.2.3 木霉P3.9菌株液體培養(yǎng) 將木霉菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板中，于28 ℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)3 d，用滅菌蒸餾水沖洗孢子，制成孢子懸浮液(1.5×106個(gè)/mL)備用[10]，分別在 500 mL 錐形瓶中裝入250 mL PD發(fā)酵培養(yǎng)液，同時(shí)接種2 mL孢子懸浮液，于28 ℃、180 r/min 搖床中培養(yǎng)7 d。然后真空抽濾菌絲體，制成濾液備用。

1.2.4 木霉P3.9菌株次生代謝產(chǎn)物對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用測(cè)定 把“1.2.3”節(jié)中獲得的木霉發(fā)酵濾液，在121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，待冷卻至45～50 ℃時(shí)，按照25%、50%、75%的比例加入已滅菌的PDA培養(yǎng)基中倒平板。另一處理將上述濾液在50 ℃水浴2 h，按照前述比例加入PDA培養(yǎng)基中倒平板。打取直徑為5 mm的枇杷根腐病病菌菌餅，分別接種于上述準(zhǔn)備好的2種平板中央，以不加木霉發(fā)酵液的PDA平板接種病菌菌餅作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。第7天測(cè)量菌落直徑。

1.2.5 木霉P3.9菌株揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用測(cè)定 將枇杷根腐病病菌和木霉菌株在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)3 d，打取直徑為5 mm的枇杷根腐病病菌菌餅分別接種于PDA平板中央，兩培養(yǎng)皿對(duì)口，用膠帶封口固定。以只接病菌的PDA平板作對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。第7天測(cè)量菌落直徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan’s多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各處理之間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用

由表1可知，12株內(nèi)生木霉對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制率均大于50%，具有較強(qiáng)的抑菌作用。相比較而言，P3.9、JD3菌株的抑菌率與其他菌株的抑菌率差異極顯著(P<0.01)，抑菌率較高，分別達(dá)到80.1%、78.1%。說(shuō)明這2個(gè)菌株的生防潛力最大。P3.9菌株分離自枇杷主干韌皮部，理論上更容易定殖于枇杷根際及其植株中，生防潛力較大。

表1 木霉菌株對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用

注：數(shù)據(jù)后不同小寫、大寫字母分別表示在0.05、0.01水平上差異顯著。表3同。

2.2 木霉菌株對(duì)枇杷根腐病病菌的拮抗等級(jí)

由表2可知，12株內(nèi)生木霉對(duì)枇杷根腐病病菌均有拮抗作用。其中，菌株P(guān)3.9、JD3的拮抗等級(jí)為Ⅱ，菌株Y2的拮抗等級(jí)為Ⅳ，其余菌株的拮抗等級(jí)均為Ⅲ。由圖1可知，J1、J3、J5、JD3、GD3、GD5、PZ1、P3.9等8個(gè)菌株菌絲覆蓋病菌的同時(shí)，其上產(chǎn)生木霉分生孢子，J1、JD3、GD3、GD5等4個(gè)菌株產(chǎn)生的孢子量相對(duì)較多；GM6、Y2菌株不產(chǎn)生分生孢子。

2.3 木霉P3.9菌株次生代謝產(chǎn)物對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用

由表3可知，內(nèi)生木霉P3.9菌株發(fā)酵濾液在50 ℃水浴2 h，低濃度發(fā)酵液(25%、50%)對(duì)枇杷根腐病病菌幾乎沒(méi)有抑制作用，抑菌率均小于2%，高濃度發(fā)酵液(75%)對(duì)病菌有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率達(dá)78.9%，且病菌周圍長(zhǎng)滿木霉分生孢子(圖2)。內(nèi)生木霉P3.9菌株發(fā)酵濾液經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌，高、低濃度均對(duì)枇杷根腐病病菌幾乎沒(méi)有抑制作用，抑菌率均小于5%。說(shuō)明P3.9菌株次生代謝產(chǎn)物遇高溫失活，喪失對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用(圖3)。

2.4 木霉P3.9菌株揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用

枇杷根腐病病菌和木霉P3.9菌株在28 ℃恒溫對(duì)扣培養(yǎng)7 d，對(duì)照病菌菌落直徑為88.0 mm，處理病菌菌落直徑為 62.3 mm，抑菌率為29.2%。說(shuō)明P3.9菌株的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用很小(圖4)。

3 結(jié)論與討論

12株內(nèi)生木霉對(duì)枇杷根腐病病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率均大于50%。其中，P3.9菌株的抑菌率最高，達(dá) 80.1%，其次為JD3菌株，其抑菌率為78.1%。P3.9菌株對(duì)枇杷根腐病病菌除了空間及營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生之外，適當(dāng)濃度的液體發(fā)酵濾液對(duì)病原菌的抑制作用也較強(qiáng)。說(shuō)明木霉 P3.9 菌株能產(chǎn)生抑制枇杷根腐病病菌的次生代謝產(chǎn)物，其揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物也具有一定的抑菌作用。JD3菌株產(chǎn)孢能力比P3.9菌株強(qiáng)，其他生物學(xué)特性是否也強(qiáng)于P3.9菌株，還有待進(jìn)一步研究。P3.9、JD3菌株對(duì)枇杷根腐病病菌的拮抗等級(jí)均為Ⅱ，Y2菌株的拮抗等級(jí)為Ⅳ，其余菌株的拮抗等級(jí)均為Ⅲ，有潛在的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值?？梢钥紤]開(kāi)發(fā)復(fù)合木霉菌劑，或與化學(xué)農(nóng)藥混配，以提高防病效果。

表2 木霉菌株對(duì)枇杷根腐病病菌的拮抗等級(jí)

我國(guó)化肥和農(nóng)藥過(guò)量施用現(xiàn)象嚴(yán)重，因此引起環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等重大問(wèn)題，農(nóng)作物綠色防控的呼聲越來(lái)越高。木霉是目前在微生物生防資源中重要的物種之一，自2013年以來(lái)，我國(guó)已用木霉菌劑成功防治玉米小斑病[11]、黃瓜根結(jié)線蟲病[12-13]、柑橘綠霉病[14]、黃瓜枯萎病[15]、茄子黃萎病[16]、人參銹腐病[17]、草莓根腐病[18]、草坪枯萎病[19]、水稻紋枯病[20]、向日葵菌核病[21]、茉莉白絹病[22]、香蕉枯萎病[23]、葡萄灰霉病[24]等多種作物病害。木霉P3.9菌株抗菌譜廣[5]，有望防治枇杷根腐病、石榴枯萎病和干腐病、菊花根腐病和葉斑病、辣椒黃萎病等。其在作物根際土壤及植株中的定殖規(guī)律，對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響及防病效果影響因素，有待進(jìn)一步研究。

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表3 木霉P3.9菌株次生代謝產(chǎn)物對(duì)枇杷根腐病病菌的抑制作用

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