HPLC法測(cè)定卵磷脂中6個(gè)成分的含量

周文君

（朝陽(yáng)市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心 遼寧 朝陽(yáng) 122000）

1.前言

在臨床醫(yī)學(xué)所使用的磷脂類材料中，磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、鞘磷脂等，均是具有藥用價(jià)值的卵磷脂，這些卵磷脂能夠在慢性肝炎、肝硬化、高膽固醇血癥等方面起到預(yù)防、治療的作用。

2.實(shí)驗(yàn)器材和原料

本文根據(jù)HPLC法的測(cè)試實(shí)驗(yàn)要求，選用了蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[1]。

實(shí)驗(yàn)樣本方面，本文選用了由上海某制藥公司提供的五組蛋黃卵磷脂作為實(shí)驗(yàn)樣本，標(biāo)示為a1～a5。此外，為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本文還分別選取了六個(gè)成分的對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，通過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比來(lái)獲取各組樣本蛋黃卵磷脂的成分含量特點(diǎn)。

3.實(shí)驗(yàn)開(kāi)展

在HPLC法當(dāng)中，針對(duì)卵磷脂的測(cè)定一般依靠色譜柱來(lái)完成，通過(guò)蒸發(fā)光散射檢測(cè)儀的照射，與色譜柱進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行分析，最終獲得樣本的特征。本文在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，選用了diol色譜柱，色譜精度為5μm，色譜柱規(guī)格為25c×0.4cm。流動(dòng)相分為A、B兩組，其中A組流動(dòng)為正庚烷：異丙醇=65∶113，B組流動(dòng)為正庚烷：異丙醇：水=31∶61∶13。其洗脫梯度的具體數(shù)據(jù)為：其中A75%和B50%為0分鐘，A50%和B50%為3分鐘，A100%則為5～11分鐘，B75%則為13～20分鐘。流速為0.8mL/min，色譜柱溫度為40℃，進(jìn)樣量為10μL。

隨后，本文依據(jù)這一數(shù)據(jù)開(kāi)展了分離度的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。分別取六種成分的對(duì)照樣品，加入到A組流動(dòng)相當(dāng)中進(jìn)行稀釋、溶解，稱之為為特定容量的溶液，其中，韓棕櫚酸甘油酯為27.5μg/ml、膽固醇450μg/ml、磷脂酰乙醇胺656μg/ml、磷脂酰膽堿3378μg/ml、鞘磷脂58.3μg/ml以及溶血性磷脂酰膽堿48.8μg/ml。隨后根據(jù)色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，獲取各蜂的分離度，并進(jìn)行符合程度測(cè)定。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

4.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果曲線

在完成了分離度測(cè)定之后，本文采用metter AE型號(hào)分析天平，對(duì)對(duì)照品磷脂酰膽堿以及磷脂酰乙醇胺進(jìn)行精密稱取，稱取計(jì)量分別為68mg和13mg，將二者共同置于20ml的量瓶之中，用A流動(dòng)相的溶液進(jìn)行混合稀釋，并將其作為儲(chǔ)備溶液。再分別量取四組儲(chǔ)備溶液，以2∶1∶1∶1的比例放置在量瓶之中，量瓶容量分別為20毫升、10毫升、10毫升和10毫升，并運(yùn)用A組流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，使其成為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和儲(chǔ)備溶液進(jìn)行精準(zhǔn)量取，在色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，隨后對(duì)棕櫚酸甘油酯和膽固醇、鞘磷脂、溶血性磷脂酰膽堿進(jìn)行精準(zhǔn)量取，分別為5.5mg、43mg、10.9mg、10.3mg，并分別放置于量瓶之中。與前者相同，運(yùn)用A組流動(dòng)相進(jìn)行混合稀釋，形成各組儲(chǔ)備液。再通過(guò)精密量取，獲取各組儲(chǔ)備液10ml、2ml、2ml和3ml，共同放置到量瓶之中，由A組流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，作為雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精準(zhǔn)量取2μL、5μL、10μL、20μL和30μL，對(duì)比色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

4.2 對(duì)數(shù)分析

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定可以獲取峰面積的對(duì)數(shù)和進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)，兩組對(duì)數(shù)分別對(duì)應(yīng)為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，進(jìn)而形成logA與logW的方程關(guān)系及及相關(guān)系數(shù)[2]，通過(guò)進(jìn)樣量的分析可以確認(rèn)線性范圍的區(qū)間，如下表：

方程及相關(guān)系數(shù) 線性范圍磷脂酰膽堿為 logA=1.840logW+2.813（r=0.9979） 1.69～33.88μg磷脂酰乙醇胺 logA=1.417logW+2.981（r=0.9996） 0.33～6.97μg棕櫚酸甘油酯 logA=1.252logW+3.200（r=0.9990） 0.17～8.83μg膽固醇 logA=1.290logW+3.097（r=0.9993） 0.88～14.83μg鞘磷脂 logA=1.116logW+2.971（r=0.9553） 0.21～3.85μg溶血性磷脂酰膽堿 logA=1.376logW+3.084（r=0.9957） 0.49～4.72μg

4.3 供試樣品測(cè)定

為了完成測(cè)試對(duì)比，本文將a1～a5五組蛋黃卵磷脂進(jìn)行了測(cè)定，選取樣品量75mg，分別放置于25mL的量瓶之中，通過(guò)A組流動(dòng)相進(jìn)行稀釋并完成混合，再將其在色譜條件當(dāng)中測(cè)定的峰值面積的對(duì)數(shù)帶入到回歸方程當(dāng)中進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算結(jié)果顯示，五組樣品的六個(gè)成分的含量十分相近，均控制在一定區(qū)間。其中，棕櫚酸甘油酯的含量為1.27±0.03μg；膽固醇的含量為8.83±0.17μg；磷脂酰乙醇胺的含量為15.88±0.37μg；磷脂酰膽堿的含量為76.93±5.98μg；鞘磷脂的含量約為2.39±0.03μg；溶血性磷脂酰膽堿的含量則為2.11±0.07μg。

5.結(jié)論

相較于其他的測(cè)量方法如薄層分析法、氣相色譜法而言，HPLC法具有簡(jiǎn)單、快捷的特征。通過(guò)檢驗(yàn)可以看出，作為同一批次的蛋黃卵磷脂，在六個(gè)成分的含量方面差別不大，這部分卵磷脂具有較好的藥用價(jià)值，能夠作為乳化劑或口服使用。

[1]杜章斌，滕英來(lái)，汪勇，等.核磁共振氫譜法測(cè)定卵磷脂、溶血磷脂和甘油磷脂酰膽堿含量[J].中國(guó)油脂，2015，40(03):83-86.

[2]祝藝娟，黃媛，晁若冰.HPLC法測(cè)定脂肪乳注射液及卵磷脂中溶血磷脂的含量[J].藥物分析雜志，2012，32(06):1048-1051.