垂序商陸葉片總皂苷的提取及殺蟲活性研究

劉媛琪，毛龍毅，閆榮玲，①，何禧源，廖 陽，①

(湖南科技學院：a. 化學與生物工程學院，b. 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，c. 湖南省銀杏工程技術(shù)中心，湖南 永州 425199)

皂苷廣泛存在于植物不同器官，具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤及抗植物病毒等作用，為近年來倍受關(guān)注且極具開發(fā)潛力的植物次生代謝產(chǎn)物之一[1]。

垂序商陸(PhytolaccaamericanaLinn.)隸屬于商陸科(Phytolaccaceae)商陸屬(PhytolaccaLinn.)，為多年生草本植物，其根具有逐水消腫、通利二便及解毒散結(jié)的藥效。垂序商陸具一定毒性，服用不當會引起腹痛和腹瀉等不良反應，因此作為中藥材使用時，需對其進行炮制等前處理并準確控制用量。垂序商陸對人體的毒性主要由于其所含的商陸皂苷A、商陸皂苷B和商陸皂苷C等皂苷類物質(zhì)所致，這些物質(zhì)可引發(fā)炎癥、溶血和細胞生理活動異常[2-5]。此外，垂序商陸皂苷對其他動物(如血吸蟲寄主釘螺)以及植物病毒(如煙草花葉病毒)等也具有一定滅殺或抑制效應，這使其在生物農(nóng)藥等植物源生物防治劑的應用及產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域表現(xiàn)出極大潛力[6-7]。目前，關(guān)于垂序商陸皂苷提取及其對特定作物害蟲滅殺效果的研究極少，且研究部位集中在根部，而更易獲取、前處理更簡單、且生物量巨大的葉片則作為廢棄物被舍棄，因此，挖掘垂序商陸葉片中皂苷的潛在價值，對其開發(fā)利用具有重要的經(jīng)濟和社會效益。

目前，研究者主要采用乙醇多次回流的方法提取植物總皂苷，但該方法存在提取次數(shù)多、耗時長等不足，這主要因為植物細胞壁增加了細胞破碎的難度并阻礙了細胞內(nèi)植物活性物質(zhì)的釋放[8-9]。纖維素酶可水解細胞壁中的主要成分纖維素，使細胞壁疏松甚至破裂和崩解，減小活性物質(zhì)向胞外釋放的傳質(zhì)阻力。微波具有穿透力強、細胞破碎效果好和對提取物破壞小等優(yōu)點，可有效減少溶劑用量、縮短提取時間、提高提取得率。近年來，纖維素酶和微波提取以及二者協(xié)同作用被越來越多應用于植物活性物質(zhì)的提取[8-10]。植物葉片中活性物質(zhì)含量隨地區(qū)、部位、株齡和月份等不同而異[11-14]，弄清垂序商陸葉片中皂苷含量隨月份的波動規(guī)律可為葉片科學采摘提供指導。為此，本文摸索了垂序商陸葉片總皂苷的纖維素酶-微波協(xié)同提取條件，分析了葉片總皂苷含量隨月份的動態(tài)變化規(guī)律，測試了總皂苷提取物對常見害蟲小菜蛾〔Plutellaxylostella(Linn.)〕的滅殺效果，以期為垂序商陸葉片的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2016年4月選取湖南科技學院附近空地長勢基本一致的40株野生垂序商陸掛牌標記，注明其科研用途進行保護。分別于2016年4月至10月的每月20日進行葉片采摘，每次隨機選取5株，被采樣后的植株不再進行后續(xù)采樣。用剪刀從植株中下部葉(不包括新葉)的基部剪斷，去葉柄后混合，迅速帶回實驗室，清洗瀝干后于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，研磨過80目篩后密封保存、備用。

主要試劑和儀器：纖維素酶(15 U·mg-1，上海展云化工有限公司)，齊墩果酸標準品(純度大于等于98%，上海源葉生物科技有限公司)，其他試劑均為分析純。JP-300B高速多功能粉碎機(永康市久品工貿(mào)有限公司)，BSA124S電子天平〔賽多利斯科學儀器(北京)有限公司〕，HH-W600恒溫水浴鍋(金昌實驗儀器廠)，XH-MC-1微波合成反應儀(北京金陽萬達科技有限公司)，UV-2400紫外分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，SHZ-D循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，RF52-A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，DGG-9053AD電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 葉片總皂苷提取條件的篩選

1.2.1.1 標準曲線繪制 參考文獻[15]繪制標準曲線。精密稱取齊墩果酸標準品10.0 mg，用甲醇定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度0.1 mg·mL-1齊墩果酸標準溶液。吸取200 μL齊墩果酸標準溶液置于具塞試管中，水浴揮干，加入質(zhì)量體積分數(shù)5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min，顯色后用冰水冷卻10 min，加冰乙酸5.0 mL，搖勻，隨行試劑作空白，于波長400～700 nm下進行全波長掃描，確定最大吸收波長為540 nm，并記錄吸光度值。在此基礎(chǔ)上，分別吸取50、100、300、400和500 μL齊墩果酸標準溶液，按照上述步驟，分別測定在波長540 nm下的吸光度值。所有實驗重復3次，以齊墩果酸標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、吸光度值為縱坐標(Y)得到標準曲線Y=0.180X+0.004，R2=0.999[15]。

1.2.1.2 總皂苷的提取及含量測定 選取7月份垂序商陸葉片樣品進行提取。參考文獻[8-9，16]并結(jié)合纖維素酶的特性及預實驗，確定提取反應體系的料液比1∶15、纖維素酶作用溫度50 ℃、pH 4.5。稱取上述垂序商陸葉片樣品5.0 g，加入體積分數(shù)75%乙醇75 mL，再加入一定量的纖維素酶，在50 ℃和pH 4.5條件下處理一定時間后，再在一定的微波提取時間和微波功率下進行總皂苷提取，之后趁熱抽濾并用甲醇定容濾液至100 mL，待測。

精密吸取200 μL總皂苷提取液置于具塞試管中，65 ℃水浴揮干，按照上述方法在波長540 nm下測定吸光度值并根據(jù)標準曲線方程計算總皂苷提取液質(zhì)量濃度，根據(jù)總皂苷提取液質(zhì)量濃度和定容后體積計算總皂苷含量(C1)，并根據(jù)公式“總皂苷得率=(C1/5.0)×100%”計算總皂苷得率。

1.2.1.3 單因子實驗和正交實驗 分別考察纖維素酶用量、纖維素酶作用時間、微波提取時間和微波功率4個因子對垂序商陸葉片總皂苷得率的影響，其中，纖維素酶用量分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.15 g·g-1，纖維素酶作用時間分別為40、60、80、100、120和150 min，微波提取時間分別為5、15、25、35、45和55 s，微波功率分別為100、200、300、400、500和600 W。進行某一單因子實驗時，其他因子保持不變，分別為纖維素酶用量0.06 g·g-1、纖維素酶作用時間100 min、微波提取時間35 s和微波功率400 W。根據(jù)單因子實驗結(jié)果，分別選取4個因子的3個較好水平進行L9(34)正交實驗。所有單因子實驗及正交實驗均重復3次。并對最佳提取條件重復3次。

1.2.2 總皂苷提取物殺蟲活性的測試方法 參照文獻[17]測試總皂苷提取物的殺蟲活性。將5月、7月和9月的垂序商陸葉片總皂苷提取液減壓濃縮至稠膏狀，于40 ℃烘干至恒質(zhì)量，然后分別稱取適量，加入少量丙酮和質(zhì)量體積分數(shù)1%吐溫80，完全溶解后用無菌水稀釋至總皂苷提取物質(zhì)量濃度為5.0 mg·mL-1，備用。吸取2份7月的待測液，用無菌水分別稀釋至總皂苷提取物質(zhì)量濃度為1.0和2.5 mg·mL-1，備用。供試小菜蛾幼蟲(1～2齡)采自湖南科技學院周邊菜地未噴過農(nóng)藥的白菜(Brassicarapavar.glabraRegel)葉片，室內(nèi)適應性飼養(yǎng)后，挑選形態(tài)大小基本一致的小菜蛾幼蟲進行實驗。將面積5 cm×5 cm的新鮮白菜嫩葉在質(zhì)量濃度1.0和2.5 mg·mL-1總皂苷提取物溶液中分別浸泡10 s后取出，揮干后放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿5片，接入經(jīng)過饑餓處理的小菜蛾，每皿10頭，每24 h更換1次葉片。以隨行試劑作為空白對照，所有實驗均重復3次，分別于接入12、24、48、72和96 h統(tǒng)計小菜蛾的死亡總數(shù)，并根據(jù)公式“校正死亡率=〔(對照組生存率-處理組生存率)/對照組生存率〕×100%”[17]計算校正死亡率，其中，生存率根據(jù)公式“生存率=〔1-(處理后小菜蛾死亡數(shù)/供試小菜蛾數(shù))〕×100%”計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2003和SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析，采用SigmaPlot 10.0軟件制圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 垂序商陸葉片總皂苷提取條件的篩選結(jié)果

單因子實驗結(jié)果(圖1)顯示：纖維素酶用量、纖維素酶作用時間、微波提取時間和微波功率均對垂序商陸葉片總皂苷得率有明顯影響。隨著纖維素酶用量、纖維素酶作用時間、微波提取時間和微波功率的增加，總皂苷得率先急劇增加然后趨于穩(wěn)定，即當纖維素酶用量為0.08 g·g-1、纖維素酶作用時間為120 min、微波提取時間為25 s以及微波功率為500 W時，總皂苷得率不再增加或增加幅度不明顯。

正交實驗結(jié)果(表1)顯示：4個因子對垂序商陸葉片總皂苷得率的影響由大到小依次為纖維素酶用量、微波功率、纖維素酶作用時間、微波提取時間，最佳提取條件為纖維素酶用量0.08 g·g-1、纖維素酶作用時間100 min、微波提取時間35 s和微波功率400 W。最佳提取條件的驗證結(jié)果顯示：該條件下垂序商陸葉片總皂苷得率為2.53%。

圖1 纖維素酶用量(A)、纖維素酶作用時間(B)、微波提取時間(C)和微波功率(D)對垂序商陸葉片總皂苷得率的影響Fig. 1 Effects of cellulase dosage (A)，cellulase action time (B)，microwave extraction time (C)，and microwave power (D) on yield of total saponins from Phytolacca americana Linn. leaves

表1纖維素酶-微波協(xié)同提取垂序商陸葉片總皂苷正交實驗結(jié)果1)

Table1ResultoforthogonaltestontotalsaponinsfromPhytolaccaamericanaLinn.leavesbycellulase-microwaveassistedextraction1)

序號No.CD/g·g-1tC/mintM/sPM/WYTS/%10.0680153001.2720.06100254001.8930.06120355001.9840.0880255001.8350.08100353002.2460.08120154002.5870.1080354002.2380.10100155002.4290.10120253001.75K11.711.782.091.75K22.222.181.822.23K32.132.102.152.08R0.510.400.330.48

1)CD：纖維素酶用量Cellulase dosage；tC：纖維素酶作用時間Cellulase action time；tM：微波提取時間Microwave extraction time；PM：微波功率Microwave power；YTS：總皂苷得率Yield of total saponins.

2.2 垂序商陸葉片總皂苷含量的動態(tài)變化分析

垂序商陸葉片總皂苷含量的動態(tài)變化見圖2。由圖2可以看出：4月至10月，垂序商陸葉片總皂苷含量呈“升高—穩(wěn)定—降低”的變化趨勢。其中，4月至8月，垂序商陸葉片總皂苷含量呈逐漸升高的趨勢，其中4月至5月總皂苷含量的增幅較小，5月至6月總皂苷含量的增幅最大，8月時總皂苷含量達到最高；8月至9月總皂苷含量維持穩(wěn)定，之后總皂苷含量急劇下降。

圖2 垂序商陸葉片總皂苷含量的動態(tài)變化Fig. 2 Dynamic change of total saponins content in Phytolacca americana Linn. leaves

2.3 垂序商陸葉片總皂苷提取物對小菜蛾的滅殺效果分析

垂序商陸葉片(7月)總皂苷提取物對小菜蛾的滅殺效果見圖3。由圖3可以看出：質(zhì)量濃度1.0、2.5和5.0 mg·mL-1總皂苷提取物對小菜蛾均具有明顯滅殺活性，且總皂苷提取物質(zhì)量濃度越高，對小菜蛾的滅殺效果越好。不同質(zhì)量濃度總皂苷提取物處理12 h，小菜蛾的校正死亡率為0.0%。質(zhì)量濃度5.0和2.5 mg·mL-1總皂苷提取物處理24 h，以及質(zhì)量濃度1.0 mg·mL-1總皂苷提取物處理48 h后小菜蛾出現(xiàn)死亡。隨處理時間的延長，不同質(zhì)量濃度總皂苷提取物處理組小菜蛾的校正死亡率逐漸升高，且在處理24～72 h增幅較大，處理72 h之后增幅明顯減緩。處理96 h時，質(zhì)量濃度5.0 mg·mL-1總皂苷提取物處理組小菜蛾校正死亡率達73.3%，遠高于質(zhì)量濃度2.5和1.0 mg·mL-1總皂苷提取物處理組(校正死亡率分別為36.7%和16.7%)。

：5.0 mg·mL-1；：2.5 mg·mL-1；：1.0 mg·mL-1.圖3 垂序商陸葉片(7月)總皂苷提取物對小菜蛾的滅殺效果Fig. 3 Insecticidal effect of total saponins extract from Phytolacca americana Linn. leaves (July) against Plutella xylostella (Linn.)

：5月May；：7月July；：9月September.圖4 不同月份垂序商陸葉片總皂苷提取物對小菜蛾的滅殺效果Fig. 4 Insecticidal effect of total saponins extract from Phytolacca americana Linn. leaves in different months against Plutella xylostella (Linn.)

不同月份垂序商陸葉片總皂苷提取物對小菜蛾的滅殺效果見圖4。由圖4可以看出：7月和9月垂序商陸葉片總皂苷提取物處理24～96 h，小菜蛾的校正死亡率均高于5月。處理72 h內(nèi)，9月垂序商陸葉片總皂苷提取物的滅殺效果較7月更佳，但處理72 h后，兩者的滅殺效果達到一致。隨處理時間的延長，5月、7月和9月垂序商陸葉片總皂苷提取物對小菜蛾的滅殺活性均呈逐漸升高的趨勢。

3 討論和結(jié)論

垂序商陸的根、莖和葉等器官在生長過程中會累積皂苷類物質(zhì)，葉片中皂苷主要富集于葉肉細胞[18]。本研究中，4月至8月垂序商陸葉片中總皂苷含量持續(xù)升高，其中5月至6月總皂苷含量增幅最大；8月總皂苷含量達到峰值后，保持穩(wěn)定；9月之后總皂苷含量急劇下降。推測可能與不同月份外界光照和溫度等環(huán)境因子的差異，以及葉片作為光合器官，在植株一年生長周期中，需不斷調(diào)節(jié)細胞主代謝與次生代謝間平衡以滿足生命活動需要有關(guān)[18-20]。建議8月至9月采摘垂序商陸葉片提取皂苷。

傳統(tǒng)的浸提法存在溶劑量大、耗時長及提取率低等不足，因此，需建立從葉片中快速、高效提取垂序商陸皂苷的工藝。微波具有很好的穿透與破碎作用，纖維素酶可有效分解覆蓋于植物細胞最外層的細胞壁，二者協(xié)同作用可在植物活性物質(zhì)提取上發(fā)揮顯著效應。纖維素酶與微波協(xié)同提取工藝具有溶劑消耗更少、所需時間更短且提取得率可觀等優(yōu)點[8，10，15，21]。本研究獲得的垂序商陸葉片總皂苷的最佳提取條件為纖維素酶用量0.08 g·g-1、纖維素酶作用時間100 min、微波提取時間35 s和微波功率400 W，該條件下葉片總皂苷得率達2.53%。垂序商陸葉片的皂苷提取得率低于根部可能與葉片中皂苷含量低于根部有關(guān)[18]。由于垂序商陸葉片較根更易獲取且生物量大，因此，本研究結(jié)果為其后續(xù)開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

垂序商陸對稠李巢蛾和朱砂葉螨等農(nóng)業(yè)害蟲等均有一定的滅殺效果[4-7]。近年來，人們開始關(guān)注其在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中的應用及生物農(nóng)藥開發(fā)。雖然垂序商陸對農(nóng)業(yè)害蟲產(chǎn)生毒性的物質(zhì)及作用機制還未闡明，但普遍認為皂苷類物質(zhì)在其中發(fā)揮了重要作用[3，22-24]。本研究認為，垂序商陸葉片總皂苷提取物可有效滅殺小菜蛾，而較低質(zhì)量濃度總皂苷提取物的滅殺效果不佳，說明與其他用于生物農(nóng)藥開發(fā)的植物活性成分一樣，垂序商陸皂苷對農(nóng)業(yè)害蟲存在致死濃度的臨界閾值[25]。本研究中，滅殺效果隨處理時間的延長還表現(xiàn)出一定的時相特征，藥效作用集中在處理24～72 h，之后的滅殺效果不明顯。推測垂序商陸葉片總皂苷被攝入小菜蛾體內(nèi)后，被迅速吸收并與受體結(jié)合，導致細胞基因表達或生理生化反應異常。上述研究結(jié)果可為后續(xù)生物農(nóng)藥配方中皂苷濃度的確定及生物農(nóng)藥的施用等提供參考依據(jù)。

不同月份垂序商陸葉片總皂苷提取物在相同質(zhì)量濃度條件下對小菜蛾的滅殺效果存在明顯差異，推測不同月份葉片中皂苷的組分及含量可能存在差異，即不同皂苷成分由于其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、含量，以及膜受體數(shù)量和信號傳導途徑等存在差異導致滅殺效果不同。垂序商陸中商陸皂苷A、商陸皂苷B和商陸皂苷C含量的變化及不同皂苷組分之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)化均會影響其毒性[18]。推測不同月份垂序商陸葉片中商陸皂苷A、商陸皂苷B和商陸皂苷C等物質(zhì)的含量可能存在差異，且不同皂苷種類隨月份變化發(fā)生相互轉(zhuǎn)化[2]。

為更好地開發(fā)利用垂序商陸皂苷，還需對提取的總皂苷進行純化及組分與含量分析，以明確其在農(nóng)業(yè)病蟲害防治中發(fā)揮關(guān)鍵作用的具體成分，為生物農(nóng)藥的開發(fā)提供準確的目標物；同時，還需進一步深入研究垂序商陸皂苷在害蟲體內(nèi)作用的受體、相關(guān)信號傳導途徑以及引發(fā)的生理生化響應等，揭示其作用機制。

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