ST細胞冷凍密度對復蘇的影響

任德強，宋新剛，張立恒

（哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，黑龍江 哈爾濱 150026）

ST細胞是豬睪丸細胞，主要用于豬細小病毒、豬瘟等疫苗的制備。為了降低長期傳代對細胞造成的損傷，需要對其進行低溫冷凍保存。低溫冷凍保存是細胞長期保存的唯一方法，還可減少細胞被微生物污染的風險，減少因傳代培養(yǎng)而引起的細胞遺傳變異和形態(tài)改變。因此要找到一個適合的凍存密度，使細胞在凍存和復蘇過程中活力下降最少。該試驗中以4個不同的密度凍存ST細胞，復蘇后檢驗活力，并分析凍存密度與活力之間的關系。

1 材料和方法

1.1 試 劑

培養(yǎng)液MEM(Gibco)；胎牛血清FBS(Gibco)；二甲基亞砜(Sigma)；Trypsin-EDTA(Gibco)。

1.2 細胞系

ST傳代細胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要儀器設備

CO2培養(yǎng)箱 (HF240型)，HealForce公司；細胞計數儀Countstar，上海睿鈺公司；細胞培養(yǎng)瓶，美國Corning公司；倒置顯微鏡（TS100），Nikon公司。

1.4 凍存液的配制

MEM的含量為60%，DMSO 10%，血清 30%。

1.5 細胞的消化

消化對數生長期的細胞，1000r/min離心 5min。

1.6 不同密度細胞液的配制

離心后棄上清液，加入適量凍存液，計數，配制4個不同密度的細胞液：0.5×107個/mL；1.0×107個/mL；2.0×107個/mL；3.0×107個/mL。

1.7 細胞分裝與凍存

將4個不同密度的細胞液進行計數，計算活力，然后分別裝入凍存管中，l.5mL/管。4℃放置2h，-80℃放置18h，放入液氮中的程序進行凍存。

1.8 細胞復蘇

細胞凍存2周后進行復蘇，每個密度復蘇3管。從液氮中取出凍存管直接放入37℃溫水中，并不時搖動使其在1 min內盡快融化。融化后以1000r/min離心5min，棄上清液，每管加入1.5mL培養(yǎng)液，計數測活力。以上操作重復3次。

2 結果

2.1 細胞凍存前的密度和活力 見表1。細胞活力都在90%以上，符合細胞凍存標準。

2.2 復蘇后細胞的密度和活力。

3 討論

豬睪丸細胞（ST）在貼壁條件下，可以實現在體外的連續(xù)培養(yǎng)，該細胞系對豬瘟、細小病毒、傳染性胃腸炎等多種病毒敏感，是疫苗生產中的常用細胞，細胞系的保存條件對疫苗生產至關重要。

上海畜牧獸醫(yī)研究所的彭麗英等人從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所引進40代ST細胞，在傳代過程中對細胞的生長速度、外源病毒檢測、染色體數目等項目進行檢測，并建立了ST細胞種子庫的凍存方法，為疫苗生產的開展奠定了工作基礎。在本研究中對ST細胞的凍存和復蘇進行研究發(fā)現，細胞復蘇后的活力也都在90%以上，3次試驗復蘇后的平均活力分別與細胞凍存前的活力相比較，3次試驗凍存前的活力雖然與細胞密度沒關系，但無論細胞是以多大的密度凍存，復蘇后，細胞的活力都會有所下降，而且會隨著凍存密度的增高而降低。雖然降低的幅度不是很大，都在90%以上，但也說明凍存細胞的密度與復蘇后細胞的活力呈反比。因此凍存細胞的密度與復蘇后細胞的活力有相關性。

表2 細胞的密度和活力測定結果

[1] 張許科，等.豬睪丸克隆細胞系及其生產豬瘟活疫苗的方法：CN，CN102965332A[P].2013.

[2] 孫秀.豬細小病毒基因組序列分析與滅活疫苗的制備及免疫效果評價[D].華南農業(yè)大學，2016.

[3] 平玲，等.ST細胞庫的建立及其生物學特性鑒定[J].山西農業(yè)科學，2013，41(8)：804-807.

[4] 張元興，等.動物細胞培養(yǎng)工程[M].北京：化學工業(yè)出版社.2007：56.

[5] 彭麗英，等.ST細胞的鑒定及種子細胞庫的建立[J].山西農業(yè)大學學報(自然科學版)，2014，34(4)：336-338.