張麗麗
(湖州師范學(xué)院,浙江 湖州 313000)
隨著年齡增加,骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生退行性變化,加速了心血管、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及其他組織器官的衰老〔1〕。因此,從骨骼肌衰老問題著手緩解整個(gè)機(jī)體衰老具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),將中青年大鼠GDF11蛋白基因敲除后骨骼肌出現(xiàn)類似衰老大鼠的特征〔2〕,提示GDF11蛋白與骨骼肌衰老存在關(guān)聯(lián)。研究已證實(shí),骨骼肌減少具有可訓(xùn)練性〔3〕,但其內(nèi)在機(jī)制仍需探討,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與老齡骨骼肌組織中GDF11蛋白表達(dá)的相關(guān)性鮮有報(bào)道。本次研究探索不同參數(shù)的間隙式負(fù)重運(yùn)動(dòng)對(duì)老齡骨骼肌衰老的影響,并分析與骨骼肌組織中GDF11蛋白表達(dá)的相關(guān)性,探討運(yùn)動(dòng)干預(yù)骨骼肌減少的可能機(jī)制。
1.1動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠24只,17月齡,體重(450±20)g,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。溫度(24±2)℃、相對(duì)濕度40%~60%條件下分籠喂養(yǎng),4只/籠,自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后稱量體重,隨機(jī)數(shù)字法分對(duì)照組(不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)干預(yù))、低負(fù)重組、中等負(fù)重組、高負(fù)重組,每組6只。
1.2訓(xùn)練方法 首先進(jìn)行無負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練7 d,各運(yùn)動(dòng)組大鼠參加,跑臺(tái)速度設(shè)定為10 m/min,30 min/d,坡度0°。之后進(jìn)行負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練7 d,各運(yùn)動(dòng)組大鼠參加,跑臺(tái)設(shè)置與無負(fù)重適應(yīng)性訓(xùn)練相同,30 min/d,在腰背部捆綁條形負(fù)荷,負(fù)重為最大負(fù)重強(qiáng)度的10%;最大負(fù)重強(qiáng)度獲取方法:逐漸在大鼠腰背部增加重量,到無法正常行走為止。正式負(fù)重訓(xùn)練:各運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行為期8 w的負(fù)重訓(xùn)練,低負(fù)重組(40%最大負(fù)重)、中等負(fù)重組(60%最大負(fù)重)、高負(fù)重組(70%最大負(fù)重),跑臺(tái)速度設(shè)定為15 m/min,坡度0°,跑3 min、休息3 min,每次共訓(xùn)練6組,1次/d,周日休息。
1.3標(biāo)本采集與處理 正式負(fù)重第8周結(jié)束后,大鼠禁食、禁水12 h,稱重后取股直肌組織標(biāo)本。腹腔注射50 mg/kg劑量的1%戊巴比妥鈉全麻后,取左側(cè)中段股直肌為骨骼肌標(biāo)本,剔去周圍脂肪,4℃蒸餾水中洗凈,液氮凍干,-80℃保存待測。
1.4骨骼肌形態(tài)學(xué)觀察及勻漿指標(biāo)測定 取部分骨骼肌組織,冷凍切片,常規(guī)行蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察切片,分析各組大鼠骨骼肌形態(tài)學(xué)改變。分別取各組大鼠骨骼肌組織300 mg,勻漿后使用脂褐質(zhì)檢測試劑盒(熒光比色法)測定脂褐質(zhì)含量,使用鈣檢測試劑盒(甲基麝香草酚藍(lán)比色法)測定組織中鈣含量,上述操作均按試劑盒說明進(jìn)行。
1.5Western印跡檢測骨骼肌組織中GDF11蛋白表達(dá) 分別取各組冷凍骨骼肌組織20 mg,加RIPA蛋白裂解液后冰上勻漿,離心取上清,使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒檢測抽提蛋白的濃度;行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,將靶向蛋白濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,滴加GDF11單抗隆抗體(1∶500),4℃孵育過夜,滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000),室溫下孵育3 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒處理,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,以β-actin為內(nèi)參,分析各條帶灰度值。
1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)。
2.1各組大鼠行為表現(xiàn)及體重變化 大鼠實(shí)驗(yàn)前精神狀態(tài)良好,飲水、飲食積極;訓(xùn)練初期各負(fù)重組大鼠飲水、飲食積極性欠佳,隨著時(shí)間延長逐漸增加,最終明顯高于對(duì)照組;中等及高負(fù)重組大鼠訓(xùn)練間隙和訓(xùn)練后均表現(xiàn)出程度不同的疲勞現(xiàn)象,但次日訓(xùn)練時(shí)均已恢復(fù)正常,低負(fù)重組大鼠疲勞現(xiàn)象不明顯。運(yùn)動(dòng)后,各負(fù)重組大鼠精神狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照組,表現(xiàn)為對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏度更高,自主活動(dòng)較多。訓(xùn)練前各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);經(jīng)6 w訓(xùn)練后各負(fù)重組大鼠體重均明顯低于訓(xùn)練前和對(duì)照組(P<0.05),其中以高負(fù)重組最明顯。見表1。
表1 各組大鼠訓(xùn)練前后體重比較
與訓(xùn)練前相比:1)P<0.05;與對(duì)照組相比:2)P<0.01
2.2各組大鼠骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化 HE染色顯示,各組大鼠骨骼肌纖維組織均出現(xiàn)不同程度的圓形化,細(xì)胞排列錯(cuò)亂且大小不一,細(xì)胞間隙增大,可見白色組織填充;其中以對(duì)照組大鼠最明顯,高負(fù)重組次之,低、中負(fù)重組較另外兩組細(xì)胞排列更緊密;中、高負(fù)重組大鼠部分肌細(xì)胞的直徑較大。見圖1。
圖1 各組大鼠骨骼肌組織形態(tài)(HE,×400)
2.3各組大鼠骨骼肌勻漿脂褐質(zhì)及鈣濃度水平比較 對(duì)照組與高負(fù)重組、低負(fù)重組與中等負(fù)重組之間脂褐質(zhì)濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低負(fù)重組與中等負(fù)重組的脂褐質(zhì)濃度明顯低于對(duì)照組與高負(fù)重組(P<0.05)。各負(fù)重組大鼠骨骼肌中鈣濃度均明顯高于對(duì)照組(P<0.05),其中以低負(fù)重組鈣離子濃度升高最明顯。見表2。
表2 6 w訓(xùn)練后各組大鼠骨骼肌勻漿脂褐質(zhì)及鈣濃度水平比較
與對(duì)照組相比:1)P<0.01
2.4各組大鼠骨骼肌GDF11蛋白表達(dá)情況 對(duì)照組、低負(fù)重組、中等負(fù)重組、高負(fù)重組大鼠骨骼肌GDF11蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.61±0.58、4.70±0.81、4.53±0.69、2.45±0.86,其中對(duì)照組與高負(fù)重組、低負(fù)重組與中等負(fù)重組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低負(fù)重組與中等負(fù)重組GDF11蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和高負(fù)重組(P<0.01)。見圖2。
圖2 各組大鼠骨骼肌GDF11蛋白Western印跡電泳圖
相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),間隙運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌具有保護(hù)作用,還可促進(jìn)骨骼肌能量供應(yīng)〔4〕。考慮到本實(shí)驗(yàn)中使用的老齡大鼠心肺功能存在衰退,故選用跑3 min、休息3 min的間隙訓(xùn)練方式;同時(shí)經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定大鼠最大負(fù)重水平,并分別給予40%、60%、70%最大負(fù)重反映不同負(fù)荷強(qiáng)度。運(yùn)動(dòng)前后對(duì)大鼠行為表現(xiàn)觀察顯示,間隙負(fù)重運(yùn)動(dòng)干預(yù)可緩解自然衰老進(jìn)程,增強(qiáng)神經(jīng)肌肉功能活性水平,其中低負(fù)重組大鼠改善更明顯,提示40%最大負(fù)重是老年大鼠較為合適的運(yùn)動(dòng)刺激。
正常衰老過程中,體內(nèi)細(xì)胞需對(duì)抗自由基損傷、病原菌入侵等各種外界刺激;細(xì)胞膜為第一道屏障〔5〕。本次研究中老年大鼠骨骼肌纖維組織出現(xiàn)了不同程度的圓形化,可能為細(xì)胞膜受外界刺激導(dǎo)致的結(jié)果;細(xì)胞間隙增大,有白色組織填充可能為老齡骨骼肌中積累的脂肪填充效果。經(jīng)間隙負(fù)重運(yùn)動(dòng)干預(yù)后,低負(fù)重組和中等負(fù)重組大鼠骨骼肌纖維組織圓形化程度明顯降低,細(xì)胞排列更緊密,提示骨骼肌細(xì)胞間隙脂肪含量明顯降低,且未對(duì)肌纖維組織造成過度損傷,延緩了正常衰老進(jìn)程;而高負(fù)重組肌細(xì)胞間隙脂肪含量增多,可能由于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過大對(duì)骨骼肌細(xì)胞造成了損傷;此外,中、高負(fù)重組大鼠肌細(xì)胞直徑變大,說明該運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可刺激部分肌纖維增粗。
脂褐質(zhì)是體內(nèi)不飽和脂肪酸對(duì)抗自由基損傷時(shí)生成的產(chǎn)物,可作為反映組織衰老的標(biāo)志物〔6〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示40%和60%最大負(fù)荷量間隙運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)骨骼肌內(nèi)自由基清除速率,進(jìn)而降低脂褐質(zhì)水平,延緩骨骼肌衰老;而70%負(fù)荷間隙運(yùn)動(dòng)屬于超負(fù)荷,對(duì)骨骼肌自由基代謝產(chǎn)生了負(fù)面影響。鈣是骨骼肌活動(dòng)的主要耦聯(lián)因子,微量的鈣元素由胞外流入胞內(nèi)即可對(duì)骨骼肌纖維產(chǎn)生明顯影響〔7〕。老齡大鼠因肌肉自身結(jié)構(gòu)改變引發(fā)胞內(nèi)鈣虧空,對(duì)胞外鈣的依賴性更高,若未得到有效補(bǔ)充,會(huì)加速肌肉衰退〔8〕。本實(shí)驗(yàn)顯示,各負(fù)重組骨骼肌中鈣濃度均明顯高于對(duì)照組。說明負(fù)重間隙運(yùn)動(dòng)可動(dòng)員更多胞外鈣,刺激機(jī)體為骨骼肌分配更多的鈣量來保證較好的運(yùn)動(dòng)功能,延緩骨骼肌衰老。GDF11蛋白是胞外鈣流入胞內(nèi)的重要調(diào)控蛋白之一,可促進(jìn)胞外鈣內(nèi)流;同時(shí)GDF11蛋白對(duì)維持骨骼肌正常解剖結(jié)構(gòu)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)顯示,低、中等負(fù)重組GDF11蛋白水平明顯高于高負(fù)重組和對(duì)照組,可能與低、中負(fù)重強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)刺激對(duì)老年大鼠較適宜,可直接或間接誘發(fā)骨骼肌組織中GDF11蛋白增多;同時(shí)還可負(fù)向影響骨骼肌收縮機(jī)制,導(dǎo)致GDF11蛋白代謝減慢。
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