通陽刮痧療法對腰椎間盤突出大鼠炎性細(xì)胞因子及機(jī)體免疫功能的影響

楊 紅 王光義 陳曉霞

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科，貴州 貴陽 550004)

腰椎間盤突出(LDH)是指腰椎間盤因外力作用或退行性病變，導(dǎo)致椎間盤組織向外部突出，從而壓迫(或刺激)馬尾神經(jīng)、神經(jīng)根所表現(xiàn)出的一種綜合征，其臨床表現(xiàn)通常為腰腿麻木、疼痛、腰部活動(dòng)受限等〔1〕。LDH具有病程長、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，對患者的生活質(zhì)量有較大的影響，若得不到有效的治療，甚至可能造成患者殘疾〔2〕。手術(shù)治療LDH有較大的風(fēng)險(xiǎn)，西醫(yī)藥物治療也常常伴有一定的毒副反應(yīng)，而我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療LDH有著較大的優(yōu)勢。LDH屬于中醫(yī)學(xué)“腰腳痛”、“腰痛”、“痹癥”等范疇，有報(bào)道表明，中醫(yī)藥物、針刺、正骨手法等治療方式治療LDH均有較為明顯的效果，同時(shí)中醫(yī)治療還具有痛苦小、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，易被患者接受〔3〕。通陽刮痧療法是一種以調(diào)整機(jī)體功能、防治疾病為目的外治法，已有研究證實(shí)其對于痹證療效確切〔4〕，但關(guān)于通陽刮痧療法治療LDH尚無相關(guān)報(bào)道。本研究采用通陽刮痧療法對建模成功的LDH模型大鼠進(jìn)行治療，觀察其對大鼠炎性細(xì)胞因子及機(jī)體免疫功能的影響，并探討其可能的機(jī)制，以期為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 10～12周齡的清潔級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量200～220 g，平均(207.68±3.47)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要儀器及試劑 流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)，腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(北京永輝生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠前列腺素(PG)E2多克隆抗體(北京華英生物技術(shù)研究所)，兔抗大鼠磷脂酶(PL)A2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.3建模及分組方法 適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組16只。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠建立LDH模型〔5〕：兩組大鼠均按劑量35 g/kg腹腔注射10%的水合氯醛，注射成功后剃除背部體毛，進(jìn)行外科常規(guī)消毒并固定。在無菌條件下，在距離鼠尾根部1 cm處切斷鼠尾，取出約4 mg髓核后縫合傷口。在鼠背部以L5棘突為中心，沿背部正中縱行切口，剝離、分開棘突兩側(cè)的骶棘肌，使得雙側(cè)L4、L5椎板均顯露。行L4下關(guān)節(jié)突、L4半椎板以及L5上關(guān)節(jié)突切除術(shù)，充分暴露L5右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)。取出的髓核在不造成機(jī)械壓迫的情況下，放置于L5右側(cè)背根神經(jīng)結(jié)，逐層縫合。術(shù)后3 d內(nèi)均單籠喂養(yǎng)，對每只大鼠均給予40萬U/d的青霉素腹腔注射以預(yù)防感染。假手術(shù)組造模及預(yù)防感染的措施同模型組，但造模過程不放置髓核即縫合傷口。造模后模型組大鼠出現(xiàn)跛行步態(tài)、煩躁、啃咬肢體、術(shù)側(cè)后爪屈曲、足下垂或握緊、術(shù)側(cè)后肢突然自發(fā)抬起、站立期明顯縮短、反復(fù)舔后爪、食量降低等表現(xiàn)，而假手術(shù)組未表現(xiàn)出上述癥狀，則判斷為造模成功。

1.4治療方法 假手術(shù)組及模型組大鼠均不給予治療。實(shí)驗(yàn)組大鼠于造模后第5天采用通陽刮痧療法：將大鼠以俯臥位固定，并將其背部毛發(fā)剪除。在大鼠背后均勻涂抹凡士林后，沿督脈的大椎到長強(qiáng)，采用自制推刮工具推刮12～15次，以出痧為度。隨后于背部脊椎兩側(cè)足太陽膀胱經(jīng)第一側(cè)線上行12～15次推刮，重點(diǎn)推刮五臟背俞穴(腎俞、肝俞、脾俞)，以出痧為度。均勻緩慢推刮任脈的膻中、中脘、氣海一線，12～15次。通陽刮痧療法隔日1次，每個(gè)療程6次，共進(jìn)行3個(gè)療程。

1.5取材和標(biāo)本處理 最后一次治療結(jié)束后1 d，大鼠均腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，劑量為35 g/kg。采取腹主動(dòng)脈采血法取4 ml全血，其中2 ml全血置于EDTAK2抗凝試管，而另外2 ml全血不抗凝于試管中靜置。采血完畢后迅速收集各組大鼠L5右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)樣本：取臥位對大鼠進(jìn)行開胸，經(jīng)左心室、主動(dòng)脈升部置管固定后將右心耳剪開，行心臟灌注。400 ml生理鹽水灌洗后，采用400 ml 4%多聚甲醛液灌注固定。隨后迅速取L5右側(cè)背根神經(jīng)節(jié)組織，并將其置于4%多聚甲醛液中固定，并在4℃下保存。

1.6觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1免疫功能指標(biāo)檢測 將EDTAK2抗凝試管中保存的全血應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定T淋巴細(xì)胞亞群水平，包括CD4+、CD8+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+。

1.6.2TNF-α檢測 不抗凝的2 ml全血于試管中靜置12～20 min后，以3 500 r/min離心15 min，分離血清置于-20℃待測。采用酶聯(lián)免疫法測定TNF-α水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.3PGE2和PLA2檢測 采用免疫組化法對背根神經(jīng)節(jié)組織中的PGE2和PLA2的陽性表達(dá)情況進(jìn)行檢測：常規(guī)脫蠟、封閉、抗原修復(fù)，將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，血清或牛血清白蛋白(BSA)封閉，加入一抗、二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片。每只大鼠隨機(jī)選取5張切片，應(yīng)用Imge-Pro Plus成像系統(tǒng)進(jìn)行攝片和觀察，隨機(jī)在每張切片中選取5個(gè)視野(400×)，取陽性細(xì)胞總數(shù)的均值。

2 結(jié) 果

2.1T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果 最后一次治療結(jié)束后1 d，模型組CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值均明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組CD4+及CD8+水平均明顯高于假手術(shù)組，但CD4+/CD8+比值明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值均明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 三組T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05,下表同

2.2血清TNF-α檢測結(jié)果 假手術(shù)組、模型組、實(shí)驗(yàn)組血清TNF-α水平分別為(21.35±4.63)ng/L、(51.62±7.34)ng/L、(33.82±5.17)ng/L。實(shí)驗(yàn)組大鼠血清TNF-α水平明顯高于假手術(shù)組大鼠，而低于模型組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3PGE2和PLA2檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中的PGE2和PLA2的陽性表達(dá)明顯高于假手術(shù)組大鼠，而低于模型組大鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 PGE2和PLA2檢測結(jié)果(個(gè)，

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為，LDH的病機(jī)核心是瘀和虛，而刮痧作為中醫(yī)自古流傳的技法之一，具有器械簡單、操作方便、費(fèi)用低廉的優(yōu)點(diǎn)，已被證實(shí)具有活血化瘀、解表祛邪、調(diào)暢氣血、疏通經(jīng)絡(luò)等作用〔6，7〕。通陽刮痧療法是全國名老中醫(yī)呂明莊教授自創(chuàng)的一種刮痧方法，此方法基于中醫(yī)針灸經(jīng)絡(luò)理論，具有防治疾病、調(diào)整身體機(jī)能的功效。督脈為“陽脈之?！?，主人體一身之陽氣，而與其在同一平面的背俞穴處在督脈兩側(cè)膀胱經(jīng)之上，與五臟六腑緊密相連，兩者經(jīng)氣相互貫通，且與臟腑之氣相通。通陽刮痧療法以推刮背部督脈和膀胱經(jīng)為主，通過調(diào)節(jié)臟腑陰陽血?dú)猓_(dá)到治本的目的。膻中疏利上焦氣機(jī)，為宗氣匯聚之所，中脘可疏通中焦、調(diào)節(jié)脾胃升降，而氣海總調(diào)下焦，為元?dú)獍l(fā)生之處。通陽刮痧療法在腹部以推刮任脈為主，通過膻中、中脘、氣海三穴調(diào)節(jié)三焦各部臟腑氣機(jī)。經(jīng)皮部-孫絡(luò)-絡(luò)脈-經(jīng)脈-臟腑的途徑，通陽刮痧療法發(fā)揮通陽導(dǎo)氣的優(yōu)勢，起到平衡陰陽、調(diào)和氣血、通經(jīng)活絡(luò)的作用。

正常的椎間盤由中心的髓核、上下軟骨板以及四周纖維環(huán)構(gòu)成，其中髓核由髓核細(xì)胞、蛋白多糖、Ⅱ型膠原等組成〔8〕。研究表明〔9〕，蛋白多糖和Ⅱ型膠原是自身抗原成分。LDH發(fā)生后，上述抗原的釋放對自身免疫反應(yīng)起到激活的作用。田鵬等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，LDH患者CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均明顯下降。本研究中模型組大鼠CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均明顯低于假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組大鼠，與上述研究結(jié)果相符，表明細(xì)胞免疫異?？赡苁荓DH的發(fā)病機(jī)制之一。而本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠CD4+/CD8+水平雖然低于假手術(shù)組大鼠，但明顯高于模型組大鼠，提示通陽刮痧療法可有效調(diào)節(jié)LDH大鼠的免疫功能。推測其原因，通陽刮痧療法可使血液及淋巴液流動(dòng)加快、血管擴(kuò)張、局部組織高度充血，在血液搬運(yùn)力量及吞噬作用增強(qiáng)的情況下，LDH大鼠體內(nèi)的廢物和毒素排出速度加快，從而全身抵抗力增強(qiáng)。同時(shí)組織胺類物質(zhì)在痧退的過程中釋放增加，對各個(gè)器官有刺激作用，各器官的功能活力得到增強(qiáng)，從而使免疫功能也得到提高。

TNF-α是一種與LDH患者神經(jīng)性疼痛密切相關(guān)的致炎因子，由吞噬細(xì)胞釋放，其在LDH患者體內(nèi)含量的異常升高可促進(jìn)神經(jīng)根浸潤，引發(fā)組織損傷并加劇炎癥反應(yīng)〔11〕。此外TNF-α還有誘導(dǎo)神經(jīng)痛覺過敏的作用，這也是LDH腰腿痛可能的機(jī)制之一〔12〕。本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠血清TNF-α水平高于假手術(shù)組大鼠，但明顯低于模型組大鼠，說明通陽刮痧療法具有控制機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用。除了TNF-α水平以外，本研究還觀察了PGE2和PLA2這兩種炎性細(xì)胞因子在背根神經(jīng)節(jié)組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中的PGE2和PLA2的陽性表達(dá)明顯高于假手術(shù)組大鼠，而低于模型組大鼠。背根神經(jīng)節(jié)作為脊髓中樞系統(tǒng)與機(jī)體內(nèi)外環(huán)境相連接的紐帶，在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生中有著重要作用。LDH患者退變或突出的髓核可產(chǎn)生多種導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)敏感性增加的炎性介質(zhì)，而PGE2和PLA2就是其中重要的兩種。PGE2是一種脂質(zhì)炎性介質(zhì)，主要由花生四烯酸代謝產(chǎn)生，與疼痛的產(chǎn)生密切相關(guān)。郭剛等〔13〕在LDH患者髓核附近的組織中檢測到PGE2活性異常升高，推測PGE2可能與LDH及坐骨神經(jīng)痛的發(fā)生存在密切關(guān)系。PLA2可以引起包括花生四烯酸在內(nèi)的一些炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，被認(rèn)為是一種局部組織炎癥發(fā)生的特殊標(biāo)志，同時(shí)其自身也是一種致痛物質(zhì)。有報(bào)道表明〔14〕，PLA2的大量表達(dá)是導(dǎo)致坐骨神經(jīng)脫髓鞘化、水腫、引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要原因。本研究結(jié)果提示，通陽刮痧療法可以降低LDH大鼠背根神經(jīng)節(jié)中的PGE2和PLA2含量，從而達(dá)到促進(jìn)損傷修復(fù)的作用。推測因出痧過程中毛細(xì)血管破裂，皮膚局部形成的淤血斑點(diǎn)正是血流外溢的表現(xiàn)，而當(dāng)血凝塊消散(痧退)時(shí)，自體溶血產(chǎn)生的新刺激素可加強(qiáng)局部新陳代謝，從而達(dá)到消炎的效果。

綜上所述，通陽刮痧療法可明顯降低LDH大鼠炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并提高其免疫功能，具有明顯的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。

4 參考文獻(xiàn)

1李慶兵，萬義文，陳科汛，等.MRI 在腰椎間盤突出癥中的應(yīng)用分析〔J〕.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015；17(4)：103-4.

2刁海靜，張建華，郭耀斌.腰背肌鍛煉對早期腰椎間盤突出癥患者生活質(zhì)量的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2017；26(3)：512-4.

3馬碧濤，金立倫，滕蔚然，等.針刺聯(lián)合紅外線照射治療腰椎間盤突出癥的隨機(jī)對照研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015；15(28)：5462-4.

4陳 睿，馮 婷，孫蘇聞，等.通陽刮痧療法治療痹證的臨床療效觀察〔J〕.基層醫(yī)學(xué)論壇，2015；19(31)：4408-9，4411.

5Han YX，Liang D，Han XR，etal.Comparative analysis of the influence of Fructus Ligustri Lucidi on a rat lumbar disc herniation model〔J〕.Mol Med Rep，2015；12(1)：1225-32.

6吳 松，梁 忠.試論刮痧“現(xiàn)瘀排瘀，調(diào)理氣血”〔J〕.中國針灸，2016；36(4)：428-30.

7Bedi HS,Jowett C,Ristanis S,etal.Plantaris Excision and Ventral Paratendinous Scraping for Achilles Tendinopathy in an Athletic Population〔J〕.Foot Ankle Int，2016；37(4)：386-93.

8張 亮.外傷性椎間盤突出的損傷程度鑒定〔J〕.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2016；31(z1)：100-1.

9吳寒松，黃世福，孫 闊，等.microRNA-25促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞外蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白合成作用〔J〕.科學(xué)技術(shù)與工程，2016；16(16)：143-8.

10田 鵬，馬信龍，王 濤，等.外周血T淋巴細(xì)胞與腰椎間盤突出類型及直腿抬高試驗(yàn)的相關(guān)性〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010；14(2)：347-50.

11曹 越，章 薇.針?biāo)幗Y(jié)合對寒濕證腰椎間盤突出癥患者血清IL-6和TNF-α的影響〔J〕.針灸臨床雜志，2016；32(1)：8-10.

12Andrade P，Hoogland G，Teernstra OP，etal.Elevated levels of tumor necrosis factor-α and TNFR1 in recurrent herniated lumbar discs correlate with chronicity of postoperative sciatic pain〔J〕.Spine J，2016；16(2)：243-51.

13郭 剛，王文輝.腰椎間盤組織髓核內(nèi)TNF-α、PGE2、PLA2表達(dá)與神經(jīng)根性疼痛的相關(guān)性〔J〕.實(shí)用疼痛學(xué)雜志，2016；12(6)：402-5.

14孫江濤，李宇衛(wèi)，沈曉峰，等.枳殼甘草湯對腰椎間盤突出模型大鼠炎癥及退變的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2016；25(8)：1488-92.