Twist對膀胱癌細胞遷移、侵襲及MMP-2、MMP-9表達的影響

王 剛 楊 濤 彭克楠 郭留雄 孫福振 谷守義 劉俊江

(河北省人民醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050051)

膀胱癌具有發(fā)病率高、致死率強等特點，且易轉移、易復發(fā)〔1，2〕。如何減少腫瘤細胞遷移和侵襲是目前延長腫瘤患者生存期的重要途徑〔3〕。Twist是一種高度保守的轉錄因子，其表達上調是誘導腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化(EMT)的重要原因，也是腫瘤細胞遷移和侵襲的重要誘導因子〔4〕。Twist在肺癌、口腔癌等腫瘤中高表達，研究顯示，Twist表達下調后可以降低胃癌、結腸癌等癌細胞的侵襲能力〔5～8〕。本研究旨在探討Twist對膀胱癌細胞侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱癌5637、T24、BIU-87細胞和正常膀胱SVHUC-1細胞購自中科院細胞庫，5637、T24、BIU-87細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI1640中，SVHUC-1細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的Ham′F12K中，細胞均放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。Prime Script RT逆轉錄試劑盒、SYBR Premis Ex Taq PCR試劑盒購自大連Takara；RNA提取試劑盒購自北京BioTeke；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自美國ImmunoReagents Inc；波形蛋白(Vimentin)一抗、基質金屬蛋白酶(MMP)-9一抗購自美國santacruze；上皮鈣黏附素(E-cadherin)一抗、MMP-2一抗購自美國Abcam；Lipofectamine2000購自美國Thermo。

1.2qRT-PCR測定Twist表達 收集膀胱癌5637、T24、BIU-87細胞和正常膀胱SVHUC-1細胞，用RNA試劑盒提取細胞總RNA，同時檢測各細胞RNA樣品A260/A280的比值(1.8～2.0)。用Prime Script RT反轉錄合成cDNA后，用SYBR Premis Ex Taq進行qRT-PCR，GAPDH為內參，分析Twist mRNA表達。引物：GAPDH上游5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-3′。Twist上游5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。引物均由上海英俊生物公司合成。

1.3Western印跡測定Twist表達 收集膀胱癌5637、T24、BIU-87細胞和正常膀胱SVHUC-1細胞，分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，添加裂解液，在冰上孵育20 min，期間震蕩3次。將細胞轉移到離心管中，4℃離心10 min。吸取上清，保存于-80℃。用二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度。取蛋白樣品，加入到等體積的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝脈電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液中，在沸水中煮5 min。變性后的蛋白保存在-80℃。變性蛋白樣品按照每個泳道40 μg添加，先用80 V電泳大約0.5 h以后，此時溴酚藍達到分離膠，再把電壓調大至120 V，2 h后，取出凝膠，在4℃，200 mA進行電轉。用5%脫脂奶粉封閉1.5 h以后，再與1∶600稀釋的Twist一抗在保鮮膜密封的蠟板上4℃過夜。再與1∶2 000稀釋HRP標記的二抗放在室溫下孵育2 h。電化學發(fā)光(ECL)，用Image J對各條帶進行灰度分析，以GAPDH為內參，計算Twist灰度值÷GAPDH灰度值，比值作為Twist蛋白水平。

1.4細胞分組及轉染 T24細胞分為3組，T24細胞用Lipofectamine2000轉染shRNA Twist后記為sh-Twist組，轉染shRNA control后記為sh-NC組，以不做任何處理的T24細胞記為Con組。細胞轉染步驟參照脂質體轉染試劑說明書，shRNA Twist、shRNA control由上海吉瑪合成。各組細胞在轉染后分別培養(yǎng)24 h，參照上述qRT-PCR和Western印跡法分別測定各組細胞中的Twist mRNA和蛋白水平。

1.5Transwell小室測定各組細胞遷移和侵襲能力 細胞侵襲和遷移能力測定均用Transwell小室進行檢測，侵襲實驗前用基質膠將Transwell濕化(用不含血清的培養(yǎng)液將基質膠以1∶3稀釋，在小室中添加40 μl，放在37℃孵育2 h)，遷移實驗不用基質膠濕化，其他步驟相同，簡述如下：Transwell小室放在24孔的培養(yǎng)板中，在實驗開始前分別用不含血清的細胞培養(yǎng)液將各組膀胱癌細胞調整為每毫升含有106個細胞，每組添加100 μl的細胞懸浮液于小室的上室中，同時在下室內加入600 μl的常規(guī)培養(yǎng)液。24 h后，將各組小室取出以后，用4%的多聚甲醛固定，結晶紫染10 min。用PBS洗滌以后，在顯微鏡下分別選取5個視野計數(shù)穿膜的細胞數(shù)目。

1.6Western印跡測定Vimentin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表達 各組細胞按照1.5中方法處理培養(yǎng)24 h以后，提取各組細胞中的總蛋白，用Western印跡方法測定細胞中Vimentin、E-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白水平?？贵w稀釋分別為：Vimentin(1∶600)、E-cadherin(1∶600)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1Twist在各細胞中表達比較 膀胱癌5637、T24、BIU-87細胞中Twist mRNA和Twist 蛋白水平均明顯高于正常膀胱細胞SVHUC-1(P<0.05)，并且T24細胞中Twist mRNA和Twist 蛋白水平明顯高于5637、BIU-87細胞(P<0.05)。見圖1和表1。Twist在膀胱癌細胞中過度表達，后續(xù)選用表達水平最高的T24做后續(xù)試驗。

2.2shRNA Twist下調膀胱癌細胞中Twist的表達 sh-Twist組Twist mRNA和蛋白水平均明顯低于Con組(P<0.05)，sh-NC組Twist mRNA和蛋白水平與Con組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2和表2。shRNA Twist下調膀胱癌細胞中Twist的表達和轉錄。

2.3各組細胞侵襲和遷移能力比較 sh-Twist組遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平均明顯低于Con組(P<0.05)，sh-NC組遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目和MMP-2、MMP-9蛋白水平與sh-Twist組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3和表2。shRNA Twist能夠降低膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力，減少基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達。

表1 Twist在膀胱癌5637、T24、BIU-87細胞和正常膀胱SVHUC-1細胞中的表達水平

與SVHUC-1相比：1)P<0.05；與T24相比：2)P<0.05

圖1 Western印跡測定Twist在膀胱癌5637、T24、BIU-87細胞和正常膀胱SVHUC-1細胞中的表達

圖2 Western印跡測定轉染后的各組細胞中Twist蛋白表達

表2 各組Twist mRNA及蛋白、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目及MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin蛋白水平比較

與Con相比：1)P<0.05

圖3 Western印跡測定各組細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達

2.4各組Vimentin及E-cadherin表達比較 sh-Twist組Vimentin蛋白水平明顯低于Con組，E-cadherin水平明顯高于Con組(P<0.05)，sh-NK組Vimentin、E-cadherin蛋白水平與Con組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4和表2。shRNA Twist能夠抑制膀胱癌細胞EMT。

圖4 Western印跡測定各組細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達

3 討 論

Twist是一種最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中的轉錄因子，其編碼的蛋白質能夠與DNA結合，含有1個內含子和2個外顯子，Twist與腫瘤有關，參與腫瘤細胞EMT，能夠促使腫瘤細胞形成新的轉移灶〔9〕。研究證實，Twist可以誘導黑素細胞轉化為黑色素瘤，并且與前列腺癌患者的預后有關，鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)Twist在腫瘤侵襲中具有重要作用〔10～12〕。研究表明，Twist在膀胱癌中表達上調，并且與膀胱癌細胞的生長、凋亡等有關，其表達下調后可以發(fā)揮抗腫瘤作用〔13，14〕。本實驗結果說明Twist在膀胱癌細胞中表達異常升高，這與上述實驗報道〔9～14〕相一致。

腫瘤轉移需要突破組織屏障，避免被免疫細胞清除，最終達到新的組織或者器官形成新的病灶，腫瘤轉移的分子機制較為復雜，細胞黏附能力、血管生成、細胞外基質降解等都與腫瘤轉移有關〔15〕。Twist作為一種癌基因參與細胞的EMT過程，在細胞EMT發(fā)生時，細胞之間的黏附能力下調，E-cadherin表達水平降低，上皮細胞特性逐漸消失，細胞逐漸表現(xiàn)出間質細胞特性，細胞的這一系列變化能夠促進細胞運動，誘導細胞遷移和侵襲〔16〕。E-cadherin能夠抑制腫瘤的轉移，其表達下調是腫瘤侵襲能力增加的重要標志，Vimentin是間質細胞標志蛋白，其在腫瘤中表達上調〔17〕。研究顯示，Twist表達上調后可以促進膀胱癌細胞中Vimentin的表達，降低E-cadherin蛋白水平，誘導膀胱癌細胞發(fā)生EMT〔18〕。本實驗結果表明，Twist敲低后的膀胱癌細胞中Vimentin水平降低，E-cadherin水平升高，細胞EMT水平下降，這與上述實驗結果類似，說明Twist敲低可以阻礙膀胱癌細胞EMT。

腫瘤轉移與腫瘤細胞突破組織屏障有關，腫瘤細胞可以分泌大量的蛋白酶，而這些蛋白酶可以降解細胞外基質，為腫瘤的轉移提供有利條件〔19〕。MMPs幾乎可以降解所有的細胞外基質，是腫瘤轉移的重要蛋白酶，MMP-2、MMP-9是MMPs家族中目前研究的與腫瘤轉移關系最為密切的兩個成員，其可以降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原酶促進腫瘤轉移〔20〕。本實驗結果提示Twist敲低可以通過下調MMP-2、MMP-9蛋白表達降低膀胱癌細胞的侵襲和遷移能力。

Twist是一種癌基因，參與腫瘤的轉移，在膀胱癌細胞中高表達，下調其表達后可以抑制膀胱癌細胞EMT，降低膀胱癌細胞侵襲和遷移能力，減少細胞表達MMPs，其具體作用機制仍需進一步探討。

4 參考文獻

1王 一，韓 婧，邢慶菲.代謝綜合征及其相關因素與膀胱癌關系的研究進展〔J〕.山東醫(yī)藥，2016；56(24)：106-8.

2Soria F，Allasia M，Oderda M，etal.Hyperthermia for non-muscle invasive bladder cancer〔J〕.Expert Rev Anticancer Ther，2016；16(3)：313-21.

3GatrRtz M，Galli U，Longerich T，etal.De novo synthesis of C4.4A in hepatocellular carcinoma promotes migration and invasion of tumor cells〔J〕.Oncol Rep，2017；38(5)：2697-704.

4Cao C，Sun D，Liang Z，etal.miR-186 affects the proliferation，invasion and migration of human gastric cancer by inhibition of Twist1〔J〕.Oncotarget，2016；7(48)：79956-63.

5Su J，Wu S，Wu H，etal.CD44 is functionally crucial for driving lung cancer stem cells metastasis through Wnt/β-catenin-FoxM1-Twist signaling〔J〕.Mol Carcinog，2016；55(12)：1962.

6孫昊軒，馮紅超，宋宇峰.Twist在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其與鱗狀細胞癌上皮間質化的關系〔J〕.華西口腔醫(yī)學雜志，2015；33(5)：534-8.

7Wang T，Hou J，Li Z，etal.miR-15a-3p and miR-16-1-3p negatively regulate twist1 to repress gastric cancer cell invasion and metastasis〔J〕.Int J Biol Sci，2017；13(1)：122-34.

8尹 偉.沉默Twist基因影響結腸癌細胞系HCT116侵襲轉移的體內實驗〔D〕.天津：天津醫(yī)科大學，2014.

9Mudry JM，Massart J，Szekeres FL，etal.TWIST1 and TWIST2 regulate glycogen storage and inflammatory genes in skeletal muscle〔J〕.J Endocrinol，2015；224(3)：303-13.

10Jinushi M，Nakazaki Y，Carrasco DR，etal.Milk fat globule EGF-8 promotes melanoma progression through coordinated Akt and twist signaling in the tumor microenvironment〔J〕.Cancer Res，2008；68(21)：8889-98.

11熊正文，王慶豐，李 偉，等.Twist蛋白在前列腺癌組織中的表達及預后關系〔J〕.中國醫(yī)師雜志，2012；14(2)：170-2.

12Li CH，Wu DF，Ding H，etal.Berberine hydrochloride impact on physiological processes and modulation of twist levels in nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2014；15(4)：1851-7.

13Fantony JJ，Longo TA，Gopalakrishna A，etal.Urinary NID2 and TWIST1 methylation to augment conventional urine cytology for the detection of bladder cancer〔J〕.Cancer Biomark，2017；18(4)：1-7.

14Fondrevelle ME，Kantelip B，Reiter RE，etal.The expression of Twist has an impact on survival in human bladder cancer and is influenced by the smoking status〔J〕.Urol Oncol，2009；27(3)：268-76.

15Kong D，Sethi S，Li Y，etal.Androgen receptor splice variants contribute to prostate cancer aggressiveness through induction of EMT and expression of stem cell marker genes〔J〕.Prostate，2015；75(2)：161-74.

16Li J，Zhou BP.Activation of β-catenin and Akt pathways by Twist are critical for the maintenance of EMT associated cancer stem cell-like characters〔J〕.BMC Cancer，2011；11(1)：1-11.

17Fendrich V，Waldmann J，F(xiàn)eldmann G，etal.Unique expression pattern of the EMT markers Snail，Twist and E-cadherin in benign and malignant parathyroid neoplasia〔J〕.Eur J Endocrinol，2009；160(4)：695-703.

18王小林，曹廣鑫，侯建全.Twist1基因對膀胱癌上皮間質轉化的影響〔J〕.交通醫(yī)學，2015；29(3)：231-3.

19Jiming GU，Lulu WU，Chen J.Expression and significance of Twist，MMP-2 and MMP-9 in colorectal carcinomas〔J〕.Jiangsu Med J，2010；36(16)：1895-6.

20Che YL，Luo SJ，Li G，etal.The C3G/Rap1 pathway promotes secretion of MMP-2 and MMP-9 and is involved in serous ovarian cancer metastasis〔J〕.Cancer Lett，2015；359(2)：241-9.