IL-12家族基因多態(tài)性對細(xì)胞因子合成及老年重癥全身感染預(yù)后的影響

李媛莉 趙繼波 李福龍 黃樹偉 李樹鐵 汪業(yè)銘 滕金亮

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000)

全身感染發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-12等均存在基因多態(tài)性〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，全身感染患者中TNFB2發(fā)生頻率增加，攜帶該等位基因的患者死亡率明顯增加〔2〕。亦有研究表明，IL-12家族中部分等位基因與全身感染發(fā)病程度和預(yù)后存在明顯關(guān)聯(lián)〔3〕；但有關(guān)細(xì)胞因子基因多態(tài)性對全身感染預(yù)后的影響機(jī)制仍未明確。本次研究通過分析IL-12家族細(xì)胞因子基因中IL-12A內(nèi)含子6區(qū)含46 bp的同向重復(fù)結(jié)構(gòu)可變數(shù)多態(tài)性、IL-12B啟動(dòng)子區(qū)511位點(diǎn)多態(tài)性及IL-12RN內(nèi)含子2區(qū)含86 bp的同向重復(fù)結(jié)構(gòu)可變數(shù)多態(tài)性中不同等位基因?qū)ν庵苎獑魏思?xì)胞IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA表達(dá)及血漿細(xì)胞因子合成的影響，探討其與老年重癥全身感染預(yù)后的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2016年1月至2017年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的老年重癥全身感染患者48例為研究組，其中男31例，女17例，年齡62～81歲，平均(69.45±7.60)歲。選取同期在醫(yī)院體檢的健康老年志愿者50人為對照組，其中男29人，女21人，年齡60～73歲，平均(66.13±4.28)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，受試者均簽署知情同意書。

1.2IL-12家族基因多態(tài)性分析 使用鹽析法從兩組受試者外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的片段，引物序列分別為：①IL-12A(內(nèi)含子6，VNTR)上游：5'-CGGAGATCTG AGTATCTTGAATCAG-3'；下游：5'-CACTCCAGTCCGGTAACGTGAC-3'。②IL-12B(內(nèi)含子6，VNTR)上游：5'-CGGAGATCTGAGTATCTTGAATCAG-3'；下游：5'-CACTCCAGTCCGGTAACGTGAC-3'。③IL-12RN(內(nèi)含子2，VNTR)上游：5'-GAGTCGTTGTGAGGATA-3'；下游：5'-AGGACCAGA-CGTCCATT-3'。反應(yīng)條件為：98℃ 2 min、96℃ 1 min、40℃ 1 min，72℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)，74℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后行瓊脂糖凝膠電泳分離目標(biāo)條帶。

1.3外周血單核細(xì)胞分離與培養(yǎng) 取對照組外周血20 ml，抗凝處理后2 000 r/min離心，收集血漿。Ficoll一步法分離單核細(xì)胞和白細(xì)胞，取白細(xì)胞層行IL-12家族基因多態(tài)性分析；取單核細(xì)胞層分離并培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/L，均勻接種到6孔板中，2 ml/孔，37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出培養(yǎng)板，向其中3孔加入終濃度為1 μg/ml的脂多糖，另外3孔加入等體積的生理鹽水為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，-20℃保存待測。

1.4細(xì)胞因子mRNA半定量分析 使用SV總RNA純化系統(tǒng)提取外周血單核細(xì)胞總RNA；RT-PCR檢測細(xì)胞因子表達(dá)，引物序列為IL-12α上游：5'-CAGAGACTTAGTCTTTAGGAAGATAG-3'；下游：5'-GTACAGTTTAAAGTGACGAAGTAGG-3'。IL-12β上游：5'-CAGAGACTTAGTCTTTAGGAAGATAG-3'；下游：5'-GTACAGTTTAAAGTGACGAAGTAGG-3'。IL-12ra上游：5'-CCGGAGGCGTCAGTGGATTAGTGAGA-3'；下游：5'-ATGATGAGCAGGAGGACCTTCATCTT-3'。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min、95℃ 1 min、40℃ 1 min，72℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)，74℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)條帶的相對表達(dá)量。

1.5細(xì)胞因子濃度檢測和預(yù)后觀察 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測研究組和對照組受試者血漿中IL-12α、IL-12β、IL-12ra濃度，檢測試劑盒購于上?？道噬锟萍加邢薰?，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。對研究組進(jìn)行為期3個(gè)月的隨訪，記錄住院及隨訪期間存活或死亡情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IL-12家族基因多態(tài)性分布情況 因IL-12A、IL-12B、IL-12RN等位基因3和4的發(fā)生頻率極低，因此本研究未對其進(jìn)行探索。研究組患者攜帶等位基因IL-12A1、IL-12A2、IL-12B1、IL-12B2、IL-12RN1頻率與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組患者攜帶IL-12RN2頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2脂多糖刺激外周血單核細(xì)胞后細(xì)胞因子等位基因表達(dá)情況 對照組外周血單核細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后，細(xì)胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra mRNA相對表達(dá)量均明顯高于生理鹽水處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；脂多糖刺激組IL-12A和IL-12B各等位基因mRNA相對表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；等位基因IL-12RN2相對表達(dá)量明顯高于IL-12RN1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3IL-12家族基因多態(tài)性對老年重癥全身感染預(yù)后的影響 研究組患者中IL-12α、IL-12β、IL-12ra細(xì)胞因子各自2號等位基因攜帶者的死亡率均明顯高于1號等位基因，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

2.4等位基因?qū)山M受試者血漿細(xì)胞因子濃度的影響 研究組各等位基因攜帶者血漿IL-12α、IL-12β、IL-12ra濃度均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；IL-12A1與IL-12A2，IL-12B1與IL-12B2等位基因攜帶者對應(yīng)的細(xì)胞因子血漿濃度之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；等位基因IL-12RN2攜帶者血漿IL-12ra濃度明顯高于IL-12RN1攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表1 兩組受試者IL-12家族基因多態(tài)性分布情況〔n(%)〕

與對照組相比：1)P<0.05

表2 對照組外周血單核細(xì)胞中細(xì)胞因子各等位基因相對表達(dá)量比較

與等位基因1相比：1)P<0.05；與生理鹽水組比較：2)P<0.05；表3同

表3 IL-12家族各細(xì)胞因子等位基因攜帶者預(yù)后情況比較〔n(%)〕

表4 等位基因?qū)山M受試者血漿細(xì)胞因子濃度的影響

與對照組相比：1)P<0.05；與IL-12RN1相比：2)P<0.05

3 討 論

不同機(jī)體對感染的反應(yīng)性存在明顯差異，當(dāng)感染程度相似時(shí)，部分患者全身炎性反應(yīng)較重，治療預(yù)后理想；而部分患者炎性反應(yīng)炎癥，病情發(fā)展迅速，常出現(xiàn)MODS或休克〔4〕。相關(guān)研究顯示，TNF B等位基因2攜帶者全身感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，炎癥感染者中TNFB2純合子死亡率明顯高于其他基因型者〔5〕。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TNF其他相關(guān)基因多態(tài)性和IL-12ra基因多態(tài)性與全身感染治療預(yù)后明顯相關(guān)〔6〕。提示細(xì)胞因子基因多態(tài)性是影響機(jī)體對感染反應(yīng)程度的主要因素之一。IL-12家族細(xì)胞因子IL-12α、IL-12β、IL-12ra在全身炎癥反應(yīng)和平衡方面具有重要調(diào)控作用；其細(xì)胞因子相關(guān)基因內(nèi)含子和啟動(dòng)子存在基因多態(tài)性〔7〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，部分等位基因?qū)蜣D(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成具有調(diào)控作用〔8〕。IL-12家族細(xì)胞因子基因多態(tài)性在調(diào)控老年人對炎性刺激的反應(yīng)性方面仍待闡明。本次研究顯示，老年重癥全身感染患者中等位基因IL-12RN2的攜帶率明顯增加且死亡率明顯升高。體外細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，等位基因IL-12RN2攜帶者外周血單核細(xì)胞受脂多糖刺激后，細(xì)胞因子IL-12ra合成量明顯高于IL-12RN1攜帶者。IL-12ra是體內(nèi)重要抗炎細(xì)胞因子，可對抗促炎細(xì)胞因子IL-1α、IL-1β的生物活性并調(diào)節(jié)體內(nèi)促炎/抗炎平衡。當(dāng)IL-12ra分泌過多時(shí)會(huì)過度增強(qiáng)體內(nèi)抗炎反應(yīng)，出現(xiàn)代償性抗炎反應(yīng)綜合征，引發(fā)機(jī)體免疫麻痹狀態(tài)。本次研究中攜帶IL-12RN2等位基因的老年全身感染患者死亡率明顯增加與IL-12ra分泌增加有關(guān)；老年全身感染患者中IL-12A2、IL-12B2攜帶者死亡率明顯增加，但對應(yīng)細(xì)胞因子的血漿濃度之間無明顯差異，可能原因?yàn)?，上述基因改變對自身編碼基因表達(dá)水平無明顯影響，但對相關(guān)的其他基因功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響老年全身性感染患者的預(yù)后。綜上所述，遺傳因素是導(dǎo)致老年全身性感染患者炎性反應(yīng)程度不同的主要原因。在IL-12RN基因多態(tài)性中，等位基因IL-12RN2攜帶者出現(xiàn)全身感染時(shí)，體內(nèi)出現(xiàn)過度免疫抑制的風(fēng)險(xiǎn)較高，引發(fā)不良預(yù)后。

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