森林土壤中多功能降解菌的分離篩選及鑒定

駱 婷,夏 虹,馮定勝,高 友,王一丁*(.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 600；.四川師范大學(xué)投資管理有限公司，四川 成都 60068)

【研究意義】土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，數(shù)量龐大且種類豐富，在形成土壤結(jié)構(gòu)、分解有機(jī)質(zhì)及礦物質(zhì)、固氮、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。土壤微生物資源的開(kāi)發(fā)利用對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的提升、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的保障和土壤可持續(xù)利用等都至關(guān)重要[2]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，土壤微生物資源的相關(guān)研究已成為當(dāng)前熱點(diǎn)，且研究重點(diǎn)多在功能性菌株的篩選與應(yīng)用。【前人研究進(jìn)展】當(dāng)前，多種功能性降解菌(如有機(jī)磷降解菌[3]、蛋白降解菌[4-5]、淀粉酶產(chǎn)生菌[6-8]、纖維素降解菌[9-10]、油脂降解菌[11-12]等)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、食品及環(huán)保等各個(gè)領(lǐng)域。但是，相比于土壤微生物的豐富性，已知功能性菌株的數(shù)量微乎其微，大量土壤微生物的篩選及功能鑒定有待進(jìn)一步加強(qiáng)。【本研究切入點(diǎn)】森林土壤表面覆蓋大量枯枝落葉，其降解與土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性緊密相關(guān)[13]，目前森林土壤微生物的研究主要集中在土壤微生物參與凋落物降解的動(dòng)態(tài)變化[14-16]，這點(diǎn)在高山、亞高山森林土壤微生物的研究中尤為突出，而對(duì)森林土壤中功能性降解菌的篩選、應(yīng)用研究涉及甚少。高山森林土壤每年會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)5～6個(gè)月的季節(jié)性凍融期，土壤凍結(jié)導(dǎo)致不耐低溫的細(xì)菌類群死亡或休眠，部分耐受低溫的細(xì)菌類群得以存活并保持一定的活性；高山森林土壤的凍結(jié)在一定程度上提高了土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)度[17]，其中可能存在產(chǎn)酶活性很高的降解菌屬?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究采集四川汶川的高山森林土壤，通過(guò)稀釋涂布平板法、透明圈法等對(duì)能夠同時(shí)降解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、油脂及過(guò)氧化氫(H2O2)的多功能資源菌株進(jìn)行分離、篩選及鑒定，以期對(duì)土壤微生物資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2015年12月，采集四川汶川海拔2950 m(E103°0′19.08″，N30°51′50.66″)森林下覆蓋腐爛落葉的土壤樣品，封于塑料袋中，標(biāo)記采樣日期、地點(diǎn)，冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①富集培養(yǎng)基。馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，pH自然；②分離培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0；③篩選培養(yǎng)基。淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏5 g/L，可溶性淀粉2 g/L，瓊脂20 g/L；油脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，花生油10 g/L，1.6 %中性紅水溶液1 mL/L，瓊脂20 g/L，pH 7.2；脫脂牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然；剛果紅培養(yǎng)基[18]：羧基纖維素鈉2.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，七水硫酸鎂0.25 g/L，硫酸銨1.0 g/L，剛果紅0.1 g/L，瓊脂20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與純化 稱取土壤樣品10 g，放入150 mL PDA液體培養(yǎng)基中，于28 ℃和100 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。吸取上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋液各100 μl涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，然后置于28 ℃中倒置培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、形狀、邊緣等初步統(tǒng)計(jì)分離細(xì)菌的種類，并將分離到的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到分離培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)[19]。

1.2.2 多功能菌株的篩選 將分離出的菌株分別點(diǎn)種到剛果紅培養(yǎng)基、脫脂牛奶培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基平板上，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)1～3 d后，根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況及菌落周圍變化進(jìn)行相關(guān)功能的鑒定[5,8,20]。菌株在篩選培養(yǎng)基生長(zhǎng)且在菌落周圍形成透明水解圈，表明該菌株具備纖維素、蛋白質(zhì)及淀粉的降解能力，同時(shí)透明圈的大小在一定程度上反映了菌株降解能力的強(qiáng)弱；因此，本研究以“透明圈直徑/菌落直徑的比值(D)”初步判定菌株的纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉的降解能力，從而進(jìn)行功能菌株的初步篩選。

將分離出的菌株點(diǎn)種到油脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長(zhǎng)情況及菌落周圍是否產(chǎn)生紅色斑點(diǎn)，若產(chǎn)生紅色斑點(diǎn)則表明菌株有降解油脂的能力[21]。油脂水解產(chǎn)生的脂肪酸致使培養(yǎng)基pH降低，培養(yǎng)基中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色，從而在菌落周圍形成深紅色的水解圈，水解圈越大，則紅色斑點(diǎn)越多，可根據(jù)水解圈大小或紅色斑點(diǎn)數(shù)量初步判斷菌株降解油脂的能力。

在無(wú)菌操作臺(tái)上，使用高溫滅菌的牙簽挑取少量菌體分別涂抹在滴有1滴3 % H2O2的載玻片上，肉眼觀察是否產(chǎn)生氣泡并依據(jù)氣泡產(chǎn)生的速率簡(jiǎn)單判定菌株分解H2O2的能力。同時(shí)，以不接菌的空白滅菌牙簽放入H2O2中觀察氣泡產(chǎn)生情況作為對(duì)照。

篩選并保存能夠同時(shí)降解蛋白質(zhì)、纖維素、油脂、淀粉和H2O2的菌株。

1.2.3 菌株的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[22]，對(duì)篩選得到的多功能菌株進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，從而進(jìn)行初步的鑒定。

分子生物學(xué)鑒定。離心收集發(fā)酵培養(yǎng)的菌體，按照康為世紀(jì)(北京)生物科技有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取總DNA.用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 基因片段。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：Mix 9.5 μl；引物27F、1429R及模板DNA各1 μl；雙蒸水12.5 μl。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，由擎科生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI上GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，然后用MEGA5.1軟件進(jìn)行序列相似性分析，以Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1000次。

表1 森林土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的多項(xiàng)降解功能鑒定Table 1 Identification of several degradation functions of bacteria in forest soil

注：“﹢”表示可降解；“﹣”表示不可降解。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及多功能菌株的初步篩選

森林土壤樣品經(jīng)富集培養(yǎng)，通過(guò)稀釋涂布法分離、純化，共得到40株可培養(yǎng)細(xì)菌，標(biāo)記為N1～N40。

采用透明圈等方法對(duì)細(xì)菌N1～N40分別進(jìn)行多項(xiàng)功能鑒定，由表1可知，40株細(xì)菌全部都能分解過(guò)氧化氫；纖維素降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌和油脂降解菌分別有37、26、35、25株，能夠同時(shí)降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉、油脂及過(guò)氧化氫的菌株共21株。

透明圈的大小能在一定程度上反映菌株的降解能力。由表2可知，經(jīng)剛果紅培養(yǎng)基平板篩選得到37株纖維素降解菌，其透明圈直徑與菌落直徑的比值在1.0～9.2，其中比值大于5的有菌株N3、N8、N14、N21、N32，菌株N14的透明圈直徑與菌落直徑的比值最大為9.2。經(jīng)脫脂牛奶培養(yǎng)基平板篩選得到的26株蛋白質(zhì)降解菌，透明圈直徑與菌落直徑的比值在1.3～4.5，其中菌株N12的比值最大為4.5，降解能力最強(qiáng)。從淀粉培養(yǎng)基平板上篩選到的35株淀粉降解菌，其透明圈直徑與菌落直徑的比值在1.3～4.3，其中菌株N32的比值最大為4.3。部分菌株的降解效果見(jiàn)圖1。

表2 纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值大小Table 2 The diameter ratio of the transparent circle to the colony of cellulose, protein, starch decomposing microorganisms

續(xù)表2 Continued table 2

菌株編號(hào)D1D2D3菌株編號(hào)D1D2D3N87.02.22.0N291.5﹣3.6N92.72.81.3N305.01.54.0N112.0﹣﹣N314.0﹣3.3N121.64.51.7N326.52.44.3N131.0﹣﹣N334.01.82.0N149.22.51.3N342.51.81.7N152.0﹣2.6N354.51.63.6N164.02.61.4N363.01.31.9N182.01.82.0N372.0﹣2.0N193.32.02.4N384.0﹣2.2N203.02.03.2N392.71.31.8N216.71.93.1N405.01.53.0N223.21.53.0

注：D1，纖維素降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值；D2，蛋白降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值；D3，淀粉降解菌透明圈直徑與菌落直徑的比值。

通過(guò)將不同菌株點(diǎn)種到油脂培養(yǎng)基上，依據(jù)菌落周圍顏色是否變紅，共篩選到25株油脂降解菌。各降解菌株在油脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后，菌落周圍出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)(表3)，其中菌株N12、N16、N19、N20菌落周圍深紅色水解圈較大(圖2)，初步判斷這4株菌的油脂降解能力較強(qiáng)；其余菌株菌落周圍的深紅色水解圈較小，或紅色斑點(diǎn)緊挨著菌苔不形成水解圈。

在無(wú)菌操作臺(tái)上，不接菌的空白高溫滅菌牙簽在H2O2中不產(chǎn)生氣泡；使用高溫滅菌的牙簽挑取少量菌體分別涂抹在滴有1滴3 % H2O2中，先后出現(xiàn)不同數(shù)量的氣泡(表3)，其中菌株N9在H2O2中產(chǎn)生的氣泡速率最快(圖3)，初步判斷菌株N9分解H2O2的能力較強(qiáng)。

2.2 森林土壤多功能菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從森林土壤中共分離到可培養(yǎng)細(xì)菌40株，其中篩選出能夠同時(shí)降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉、油脂和H2O2的多功能菌株21株，21株可培養(yǎng)多功能細(xì)菌的菌體形態(tài)特征見(jiàn)表4。

A.剛果紅培養(yǎng)基；B.脫脂牛奶培養(yǎng)基；C.淀粉培養(yǎng)基A. Congo red medium; B. Skim milk medium; C. Starch medium圖1 菌株在選擇培養(yǎng)基上的降解效果Fig.1 The degradation effect of the strains on the selection medium

表3 菌株對(duì)油脂和過(guò)氧化氫的降解結(jié)果Table 3 The result of bacteria degrading oil and hydrogen peroxide

注：“﹣”表示無(wú)；“﹢”表示少；“﹢﹢”表示多；“﹢﹢﹢”表示很多。

2.2.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 通過(guò)對(duì)21株可培養(yǎng)多功能細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在GenBank中用blast進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表5。其中，菌株N19與芽孢桿菌屬Bacillussp.(HM567046.1)、N21與解淀粉類芽孢桿菌Paenibacillusamylolyticus(AB115960.1)的序列相似率達(dá)99 %，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)后位于同一分支上，結(jié)合其菌體特征可知，菌株N19、N21分別屬于芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。N8和N34與 泛菌屬Pantoeasp.(KJ865571.1)的序列相似性最大，但只達(dá)66 %，這就顯示出采樣區(qū)森林土壤微生物種群可能存在新的物種資源[23]。另外，從圖3可知，其他17株多功能細(xì)菌均屬于假單胞菌屬，其中， N3、N14和N20；N23、N39和N40；N12、N16、N22和N30分別位于同一分支，相互之間親緣關(guān)系高達(dá)99 %，可以確定它們分別屬于同一個(gè)種，但其各自之間的形態(tài)特征有所不同(表4)，可見(jiàn)它們很可能是同一個(gè)種下的不同菌株[24]；N26與惡臭假單胞菌Pseudomonasputida(KF285966.1)、N32與Pseudomonasvranovensis(KC246044.1)、N36與米氏假單胞菌Pseudomonasmigulae(KP762559.1)的序列相似率達(dá)97 %以上，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)后，分別位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上；N24與Pseudomonassp.(JQ977479.1)達(dá)100 %，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)后位于同一分支上。

D.油脂降解；E.過(guò)氧化氫降解D. Oil degradation;E. Hydrogen peroxide degradation圖2 部分菌株的油脂降解和過(guò)氧化氫降解結(jié)果Fig.2 The result of some bacteria degrading oil and hydrogen peroxide

表4 21株土壤可培養(yǎng)多功能細(xì)菌的形態(tài)特征Table 4 Morphological characteristics of 21 Soil cultured bacteria

綜上所述，經(jīng)16S rDNA基因測(cè)序及同源性比對(duì)分析，21株可培養(yǎng)多功能資源菌歸屬于4個(gè)屬，其中絕大多數(shù)屬于假單胞菌屬(17株，80.95 %)，表明假單胞菌屬是采樣區(qū)森林土壤的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。

表5 森林土壤可培養(yǎng)多功能細(xì)菌測(cè)序比對(duì)結(jié)果Table 5 The result of blast by Genbank of the multifunctional strains in forest soil

續(xù)表5 Continued table 5

菌株編號(hào)相似菌株相似度登錄號(hào)N21Paenibacillus amylolyticus99AB115960.1N22Pseudomonas sp. CCOS 86499LT009706.2N23Pseudomonas sp. GT 4-0499KM253092.1N24Pseudomonas sp. Bma1100JQ977479.1N26Pseudomonas putida98KF285966.1N30Pseudomonas sp. CCOS 86499LT009706.2N32Pseudomonas vranovensis99KC246044.1N33Pseudomonas sp. EA_S_5499KJ642298.1N34Pantoea sp. MSc-166KJ865571.1N35Pseudomonas sp.strain Hc02598KY465519.1N36Pseudomonas migulae99KP762559.1N39Pseudomonas sp.AT-A-S699KU671213.1N40Pseudomonas sp.AT-A-S699KU671213.1

圖3 森林土壤多功能細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree of the multifunctional strains in forest soil

3 討 論

土壤作為最豐富的菌種資源庫(kù)，所含微生物數(shù)量巨大，以細(xì)菌居多[25]。馬麗艷木·阿木東等[26]使用LB和TSA兩種培養(yǎng)基從新疆沙雅縣極端干旱的胡楊林土壤中共分離出57株可培養(yǎng)細(xì)菌，分別屬于13個(gè)屬，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)為主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。何小麗等[27]采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，從上海市大蓮湖池杉林濕地土壤中共分離得到20個(gè)菌落形態(tài)不同的菌株，分別屬于9個(gè)屬，其中芽胞桿菌屬(Bacillus)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)菌。由此可見(jiàn)，因環(huán)境差異，不同類型不同地區(qū)土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌種類數(shù)量、優(yōu)勢(shì)菌群不盡相同。此外，李淼等[28]采用NM、TSA、R2A 3種培養(yǎng)基從我國(guó)高海拔凍土區(qū)的4個(gè)土壤樣品中分離得到102株細(xì)菌，經(jīng)16S rRNA 基因部分序列分析表明它們歸屬于5個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌群為假單胞菌屬(Pseudomonas)。相比之下，本文研究結(jié)果表明了該地區(qū)高山森林土壤具有較高的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，并且在分解枯枝落葉中發(fā)揮重要作用的優(yōu)勢(shì)菌群與我國(guó)其他高海拔地區(qū)的研究結(jié)果[28]一致，這可能與這類細(xì)菌適應(yīng)低溫環(huán)境有關(guān)。本研究只選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離，可能導(dǎo)致獲得細(xì)菌的數(shù)量和種屬有限，采用更多的培養(yǎng)基或改良培養(yǎng)基等進(jìn)一步分離土壤微生物菌種資源，以及結(jié)合宏基因組學(xué)等免培養(yǎng)分析技術(shù)可促進(jìn)對(duì)高山森林土壤微生物多樣性特征的認(rèn)識(shí)。

由于微生物肥料等土壤微生物制劑在生產(chǎn)生活中廣泛使用及巨大作用[18,30-31]，人們?cè)絹?lái)越偏向從不同類型土壤尤其是特殊環(huán)境土壤中篩選功能性菌株加以應(yīng)用。比如：李靜等[32]通過(guò)篩選得到15株纖維素降解菌，構(gòu)建復(fù)合菌系來(lái)研究其對(duì)秸稈的降解，且降解效果較好。賀軍軍等[12]從甘蔗渣堆積場(chǎng)分離的54個(gè)菌株中篩選出21個(gè)有降解淀粉能力的菌株，并借此研究甘蔗渣更高效的處理方法。孟靜等[32]從受油脂污染的土壤中分離出13株細(xì)菌，篩選得到9株油脂降解菌，通過(guò)優(yōu)化降解條件以達(dá)到高效處理油脂廢水的目的。但當(dāng)前高山森林土壤中功能性菌株的分離、篩選及應(yīng)用研究相對(duì)較少；本研究從高山森林土壤分離得到的40株可培養(yǎng)細(xì)菌中，具有過(guò)氧化氫降解功能、纖維素降解功能、蛋白降解功能、淀粉降解功能和油脂降解功能的菌株分別占100 %、92.5 %、65 %、87.5 %和62.5 %，功能菌數(shù)量多、降解能力較高。本研究篩選到的纖維素降解菌中，透明圈與菌落直徑比大于5的菌株有5株，相比濕地[33]等類型土壤，高山森林土壤中纖維素降解菌的降解能力更強(qiáng)，猜測(cè)可能與高山森林土壤存在凍融期，土壤微生物降解森林下枯枝落葉層周期短有關(guān)。

隨著人類大規(guī)模生產(chǎn)生活的需要，微生物菌種資源的基礎(chǔ)及開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究逐步受到重視，而高山森林土壤中資源菌的分離、篩選及開(kāi)發(fā)作為微生物菌種資源研究的重要方向，其研究尚顯不足。本文通過(guò)對(duì)高山森林土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離，以及初步篩選已分離細(xì)菌的多種降解功能，有助于初步了解森林土壤微生物的產(chǎn)酶活性；同時(shí)通過(guò)對(duì)降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉、油脂和過(guò)氧化氫的21株多功能資源菌株的分子鑒定，初步認(rèn)識(shí)了高山森林土壤中功能性資源菌株的多樣性和群落結(jié)構(gòu)。可以說(shuō)，本文研究成果為高山森林土壤資源菌的應(yīng)用奠定了較好的研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究方向主要在于功能性資源菌株復(fù)合菌系的構(gòu)建以及它們?cè)谔岣咿r(nóng)業(yè)耕地土壤肥力和改善農(nóng)作物品質(zhì)方面的應(yīng)用及效果研究。

4 結(jié) 論

本研究從四川汶川的高山森林土壤中分離得到細(xì)菌40株，從中篩選出能夠同時(shí)降解纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉、油脂及過(guò)氧化氫的菌株共21株，其中篩選到的纖維素降解菌中，透明圈與菌落直徑比大于5的菌株有5株。經(jīng)鑒定這21株多功能資源菌歸屬于4個(gè)屬，其中絕大多數(shù)屬于假單胞菌屬(17株，80.95 %)，是該地區(qū)土壤的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。本文研究結(jié)果表明該地區(qū)高山森林土壤具有較高的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，其中的功能菌數(shù)量多且降解能力較高，因此，該結(jié)果在高山森林土壤資源菌的應(yīng)用方面奠定了較好的研究基礎(chǔ)。

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