綿羊體外胚胎對移植受胎率及后代生長性能的影響

汪立芹, 陳大勇, 周 云, 陳 瑩, 林嘉鵬, 吳陽升, 黃俊成*

(1. 農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點開放實驗室,新疆 烏魯木齊 830000;2.內(nèi)蒙古賽諾草原羊業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000;3.江蘇省蘇州市相城區(qū)農(nóng)業(yè)局黃橋動物防疫站,江蘇 蘇州 215131)

【研究意義】超數(shù)排卵及胚胎移植技術(shù)(MOET)是提高優(yōu)秀母畜繁殖力的有效方法和措施，也是胚胎生物工程中必不可少的組成部分。但做了多次胚胎移植的供體，就存在子宮角、輸卵管、卵巢等相互粘連的情況，無法再用來沖胚，甚至無法繁殖后代。若體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)(IVP)的卵母細胞來源于這些供體，IVP就能成為MOET的有效補充，能使每只供體在胚胎移植的基礎(chǔ)上又可多得后代，達到“廢物利用”的目的?！厩叭搜芯窟M展】隨著體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)在牛[1]、綿羊和山羊[2-3]等動物上研究的深入，將逐步應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)，未來的應用規(guī)模也將越來越大。MOET技術(shù)一般以移植桑椹至囊胚期的胚胎為主，包括牛[4]、綿羊[5]、山羊[6]的胚胎移植。但此時期胚胎回收率要低于2～8細胞期的早期胚胎[7]。【本研究切入點】因而，為了最大限度地提高供體生產(chǎn)效率，需要研究早期胚胎移植受胎率、產(chǎn)羔率是否與胚胎數(shù)量有關(guān)，尤其是移植胚胎的數(shù)量對體外胚胎移植效率的影響，而這方面的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對體外胚胎與體內(nèi)胚胎移植效果的比較，可以直觀反應二者之間的差距，并且通過對后代生產(chǎn)性能的檢測，為確定體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)能否大規(guī)模推廣應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究在新疆巴里坤健坤牧業(yè)有限公司和內(nèi)蒙古賽諾草原羊業(yè)有限公司實施，于2015-2016年秋季進行。供體羊為體格健壯、無明顯疾病癥狀的薩?？思兎N母羊。使用的海綿栓和CIDR栓為新西蘭輝瑞公司生產(chǎn)，促卵泡激素(FSH)、氯前列醇鈉(PG)、孕馬血清(PMSG)和垂體促黃體素(LH)為寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，體外培養(yǎng)試劑除特殊標注外皆由Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 胚胎來源

體內(nèi)胚胎：將CIDR栓放置于供體母羊陰道內(nèi)，設為第0天，在放栓第10天，供體開始肌肉注射總劑量為210 mg的FSH，共注射6針，每次注射間隔12 h，劑量逐漸遞減，注射第5針FSH的同時，肌肉注射PG 1 mL，并撤去CIDR栓，12 h后用試情公羊試情，發(fā)情母羊做好標記，肌肉注射200 mg LH，禁食禁飲。發(fā)情12 h后，用腹腔鏡向雙側(cè)子宮角各輸精0.1 mL稀釋后的新鮮精液。在供體羊發(fā)情的第3天時，使用手術(shù)方式，從輸卵管傘沖出2～8細胞期的早期胚胎，沖胚液和胚胎保存液購自澳大利亞ICP公司。

體外胚胎：使用因多次胚胎移植等原因?qū)е螺斅压?、子宮角、腹膜相互粘連而無法繼續(xù)使用的薩?？四秆蜃鳛楣w，在其陰道內(nèi)放置海綿栓，F(xiàn)SH劑量、處理方式同體內(nèi)胚胎的供體，只需注射6針FSH, 不注射PG，第5針時禁飲禁食12～24 h，通過活體采卵，回收卵母細胞，按照陳大勇等[3]描述的方法，得到2～8細胞期的體外受精早期胚胎。

1.3 受體羊的處理

受體羊需進行同期發(fā)情處理，因其發(fā)情時間集中在撤栓后36～48 h，所以撤栓時間與供體略有不同。體內(nèi)胚胎移植用的受體羊，早于供體12 h撤栓，即供體注射第4針FSH時撤栓，同時肌肉注射孕馬血清(PMSG)330 IU和PG 1 mL，發(fā)情時間在供體發(fā)情時間的±12 h內(nèi)可以使用，超過該范圍內(nèi)的受體棄用。體外胚胎使用的受體羊，撤栓時間為供體注射第5針FSH時，發(fā)情時間在體外受精前后12 h內(nèi)的受體羊留用，否則棄用。移植手術(shù)前24 h禁飲禁食。

1.4 胚胎移植

通過手術(shù)方式，將輸卵管暴露于體外，從傘部移植早期胚胎。根據(jù)實驗設計，每只受體移植1枚或2枚體內(nèi)或體外早期胚胎，同時肌肉注射黃體酮0.1 mL。胚胎移植40 d左右，用B超檢測受體懷孕率(懷孕母羊數(shù)/移植受體數(shù))，5月后統(tǒng)計產(chǎn)羔率(產(chǎn)羔數(shù)/移植受體數(shù))。

1.5 后代生產(chǎn)性能測定

胚胎移植后代出生后及時稱量其初生重，確定羔羊性別，于3月齡時統(tǒng)計羔羊成活率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件的t檢驗方法，以平均數(shù)±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊體外早期胚胎數(shù)量對移植效果的影響

由表1顯示，將體外受精獲得的綿羊早期胚胎隨機移植1枚或2枚至同期發(fā)情受體輸卵管內(nèi)。移植40 d后B超檢測懷孕率結(jié)果：移植2枚早期胚胎的受胎率為60.42 %，顯著高于移植單枚胚胎的受胎效果48.54 %(P<0.05)。且產(chǎn)羔率(74.68 %)極顯著高于移植單胚的41.96 %(P<0.01)。

表1 體外早期胚胎數(shù)量對移植效果的影響Table 1 The effect of in vitro early embryo on transplantation

注：同列數(shù)據(jù)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different capital letters in the same column have extremely significant difference(P<0.01).

表2 單枚體內(nèi)或體外胚胎對移植效果的比較Table 2 Comparison of the effects of single in vivo or in vitro embryos on transplantation

表3 2枚體內(nèi)或體外胚胎對移植效果的比較Table 3 Comparison of the effects of two in vivo or in vitro embryos on transplantation

2.2 單枚體內(nèi)胚胎和體外胚胎對移植效果的比較

表2顯示，將移植胚胎數(shù)量同為單枚的體內(nèi)胚胎和體外胚胎移植效果相比較，通過t檢驗方法分析后發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)胚胎受胎率(64.12 % vs 48.54 %，P<0.05)和產(chǎn)羔率(62.88 % vs 41.96 %，P<0.05)都顯著高于體外胚胎。

2.3 移植雙枚體內(nèi)或體外胚胎對受胎率影響的比較

表3顯示，將移植胚胎數(shù)量同為2枚的體內(nèi)胚胎和體外胚胎移植效果用t檢驗比較，無論是受胎率(67.87 % vs 60.42 %)還是產(chǎn)羔率(84.93 % vs 74.68 %)，二者間沒有差異(P>0.05)。

2.4 胚胎來源對后代性別比例的影響

表4顯示，將自然繁殖、體內(nèi)胚胎移植和體外胚胎移植的后代公母羔比例進行統(tǒng)計分析，體外胚胎移植后代公羔數(shù)比例為52.9 %，顯著高于自然繁殖的公羔數(shù)比(44.08 %)(P<0.05)；體內(nèi)胚胎移植后代公羔比例為51.4 %，介于體外胚胎和自然繁殖直接，且與二者差異皆不顯著(P>0.05)。

2.5 胚胎來源對羔羊初生重的影響

表5顯示，體外胚胎移植的后代初生重平均為4.98 kg，極顯著低于體內(nèi)胚胎后代的6.2 kg(P<0.01)，但與自然繁殖后代沒有差異(P>0.05)。而3月齡的體重達到37.03 kg，與自然繁殖組和體內(nèi)胚胎組沒有差異。三者間3月齡存活率在90.15 %～91.9 %，也沒有差異(P>0.05)。

3 討 論

MOET因技術(shù)成熟、操作簡單，自20世紀70年代已在普通的養(yǎng)殖企業(yè)中得到廣泛應用，與20世紀40年代的人工授精技術(shù)發(fā)展相似，成為優(yōu)良種畜常規(guī)的繁殖方法。隨著體外受精技術(shù)研究的深入，IVP將會繼MOET后成為新的應用趨勢[8]。自40多年前，在首次獲得人的試管嬰兒以來，輔助生殖技術(shù)(ART)取得了顯著的進步[9]，動物體外胚胎的研究也越來越多。Bhandari S等[10]覺得，在人的體外胚胎移植中，并不是移植的胚胎數(shù)量越多越好，但在動物生產(chǎn)中，需要充分考慮移植胚胎數(shù)量與生產(chǎn)效率的關(guān)系。

表4 胚胎來源對后代性別比例的影響Table 4The effect of embryonic origin on the sex ratio of offspring

表5 胚胎來源對羔羊初生重的影響Table 5 The effect of embryonic origin on the birth weight of lamb

通過超數(shù)排卵處理，薩?？斯w可以得到2～8細胞期的早期胚胎8枚左右。每只同期發(fā)情的受體移植單枚胚胎和移植2枚胚胎的受胎率間沒有差異，均在60 %以上。雖然移植2枚胚胎產(chǎn)羔率高于單枚的20 %以上，但從整體生產(chǎn)效率計算，移植單枚胚胎反而高于2枚胚胎20 %。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻，該方面的研究報道極少，只有1985年王達珍[11]等通過對54只細毛羊移植單枚2～16細胞期胚胎的受胎率進行了統(tǒng)計，懷孕率高達76 %，產(chǎn)羔率為69.81 %，與本研究結(jié)果相近，但其沒有進行移植2枚胚胎的對照結(jié)果。因此，體內(nèi)早期胚胎應以移植單枚胚胎為主，生產(chǎn)效率最高。

哺乳動物體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)在我國因受卵母細胞來源質(zhì)量的限制，目前主要作為技術(shù)平臺，應用于實驗室的各類研究[12-13]。除了在人類試管嬰兒中應用較為廣泛外[14-15]，其他動物的體外胚胎很少在生產(chǎn)中進行移植。對于早期體外胚胎數(shù)量對移植受胎效果影響的研究參考數(shù)據(jù)較少。本研究通過對體外早期胚胎的移植結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn)，移植單枚胚胎的受胎率雖然只低于雙胚的11.88 %，但產(chǎn)羔率卻降低了約32.72 %，綜合生產(chǎn)效率只比移植雙枚胚胎高4.62 %(41.96-74.68/2)，再加上受體飼養(yǎng)管理和胚胎移植的成本，移植單枚胚胎的經(jīng)濟效益低于移植2枚胚胎的。因此，相對于體外早期胚胎，每只受體移植2枚更為經(jīng)濟。

Corcoran D等[16]證明，體內(nèi)和體外胚胎經(jīng)培養(yǎng)誘導的轉(zhuǎn)錄和翻譯因子mRNA豐度的變化明顯。Rizos D等[17]通過實驗證實，雖然來源于體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)液培養(yǎng)獲得囊胚的數(shù)量之間沒有差異，但在體內(nèi)培養(yǎng)獲得的囊胚經(jīng)玻璃化冷凍后的存活率要高于體外受精的胚胎，從而說明體內(nèi)胚胎質(zhì)量高于體外胚胎。Enright BP等[18]研究了體內(nèi)外胚胎冷凍保存后的存活率，結(jié)果表明，體外培養(yǎng)胚胎冷凍后的存活率顯著低于在母羊輸卵管中培養(yǎng)的體外受精胚胎或由供體超排獲得的胚胎。因而，以上幾位研究者的結(jié)果可以證明，體外胚胎的質(zhì)量比體內(nèi)胚胎差。比較了分別移植1枚2～8細胞期體內(nèi)或體外早期胚胎妊娠結(jié)果，體外胚胎的受胎率和產(chǎn)羔率都顯著低于體內(nèi)胚胎，進一步驗證了體外胚胎質(zhì)量要低于體內(nèi)胚胎。但每只受體移植2枚體內(nèi)或體外胚胎，二者間的懷孕率和產(chǎn)羔率卻沒有差異，具體原因需待進一步研究。值得借鑒的是，人類的IVF-ET，也以移植2枚胚胎為主[19]。

對于種綿羊生產(chǎn)企業(yè)，公羔比例越高，生產(chǎn)效益越好。通過本研究發(fā)現(xiàn)，體外胚胎移植后代的公羔比例顯著高于自然繁殖組，與體內(nèi)胚胎移植后代雖然沒有統(tǒng)計學差異，但也略高于后者。雖然后代初生重要低于體內(nèi)胚胎移植組，但3月齡的體重卻沒有差異，且存活率也沒有統(tǒng)計學差異。因此，體外胚胎移植對后代的生產(chǎn)效率沒有影響，可以在生產(chǎn)中大規(guī)模推廣應用。

4 結(jié) 論

移植早期體外胚胎應以移植2枚為主；移植1枚體內(nèi)早期胚胎的生產(chǎn)效率最高；體外胚胎對后代生產(chǎn)性能沒有影響，因此，體外胚胎能在生產(chǎn)實踐中進行應用。

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