轉(zhuǎn)GO基因水稻雜交后代對稻瘟病及紋枯病的田間抗性評價(jià)

謝 戎， 劉成元， 李永洪， 何 珊，向箭宇

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所/農(nóng)業(yè)部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 德陽 618000；2.農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

【研究意義】稻瘟病(Rice blast)和紋枯病(Rice sheath bight)是水稻生產(chǎn)上2種重要的真菌病害。稻瘟病在田間從水稻秧苗期開始以為害葉片為主，嚴(yán)重時(shí)造成化苗；灌漿后為害穗頸、枝梗及穎殼等，嚴(yán)重時(shí)造成穗頸折斷而大幅減產(chǎn)。紋枯病在田間從水稻分蘗盛期開始以為害葉鞘為主，逐步向上為害上部葉鞘及葉片，嚴(yán)重時(shí)造成上部葉片枯死及后期倒伏，也嚴(yán)重影響產(chǎn)量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】稻瘟菌[Magnaporthegrisea(Hebert)Barr.]及紋枯菌(RhizoctoniasolaniKühn)侵染水稻的機(jī)制各不相同，前者為?；郧秩荆笳邽榉菍；郧秩綶1-4]。由于稻瘟菌與水稻品種的?；曰プ鳎斐煽共∑贩N在生產(chǎn)上使用3～5年后喪失其抗病性[5-6]。而紋枯菌寄主范圍寬、腐生性強(qiáng)，使得目前水稻中尚未發(fā)現(xiàn)對該病免疫或高抗的水稻種質(zhì)[7-8]。大量研究表明，一些外源基因能誘導(dǎo)寄主在受到病菌侵染時(shí)產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance SAR)[9 -12]，這為培育抗稻瘟病、紋枯病的新品種提供了新的技術(shù)手段。前文對轉(zhuǎn)GO基因雜交后代株系對稻瘟病生理小種的抗譜進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)有的后代株系抗病頻率達(dá)80 %以上，明顯高于其親本[13]，但在田間的抗感反應(yīng)需進(jìn)一步觀察?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文對轉(zhuǎn)GO基因雜交后代對稻瘟病和紋枯病的田間抗性進(jìn)行了初步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以便為新品種培育提供新的抗源，為抗病機(jī)制研究提供新材料。

表1 46個(gè)GO基因雜交后代組合來源及編號Table 1 Name and code of 46 transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene

1 材料與方法

1.1 供試材料

46個(gè)GO基因雜交后代來源及編號見表1，2013年世代為F5，2015年為F7，2016年為F8。配制雜交組合的5個(gè)恢復(fù)系：明恢63、樂恢188、縉恢21、R473、H103來源于本課題親本圃。以LJH為稻瘟病對照，Lemont為紋枯病對照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病圃自然誘發(fā)鑒定 試驗(yàn)分別于2013、2015及2016年在本所敘永水尾稻瘟病圃進(jìn)行。每年3月20日播種，地膜濕潤秧。將恢復(fù)系明恢63及普感品種LJH混合作為誘發(fā)品種，待誘發(fā)品種秧苗3葉1心時(shí)接種上年收集的病稻草。每個(gè)供試材料栽1行10窩，3～4苗/窩，栽培規(guī)格16.5cm × 19.8cm，兩廂供試材料之間栽2行誘發(fā)品種。待誘發(fā)品種充分發(fā)病時(shí)調(diào)查葉瘟，抽穗后20 d調(diào)查穗頸瘟，同時(shí)調(diào)查紋枯病發(fā)病情況。

1.2.2 調(diào)查標(biāo)準(zhǔn) ⑴病葉率( %)= 病葉數(shù) / 調(diào)查總?cè)~數(shù) × 100。葉瘟分級標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)材料調(diào)查30片葉，按下列標(biāo)準(zhǔn)記載每葉發(fā)病級別，計(jì)算病情指數(shù) %=∑(各級病葉數(shù) × 各級代表值)/ (調(diào)查總?cè)~數(shù) × 最高級代表值) × 100(下同)。

0級：無病斑；1級： 針頭大小的褐點(diǎn)或無產(chǎn)孢中心的較大褐點(diǎn)；2級： 圓形至橢圓灰色壞死小斑，直徑1～2 mm，邊緣褐色，絕大多數(shù)病斑分布在下部葉片；3級： 病斑型同2級，絕大多數(shù)病斑分布在上部葉片；4級： 典型病斑，病斑長度3 mm以上，常局限于2條葉脈之間，侵染葉面積小于2 %；5級： 典型病斑，侵染葉面積2 %～10 %；6級： 典型病斑，侵染葉面積11 %～25 %；7級： 典型病斑，侵染葉面積26 %～50 %；8級： 典型病斑，侵染葉面積51 %～75 %，部分葉片枯死；9級： 典型病斑，侵染葉面積大于75 %，絕大多數(shù)葉片枯死。

⑵病穗率( %)= 病穗數(shù) / 調(diào)查總穗數(shù)×100。頸瘟分級標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)材料調(diào)查30穗，按下列標(biāo)準(zhǔn)記載每穗頸瘟級別，計(jì)算病情指數(shù)。

0級(免疫)： 全穗無??；1級(高抗)： 枝梗瘟，小于5 %谷粒受枝梗瘟影響；3級(抗)： 枝梗瘟，5 %～10 %左右谷粒受枝梗瘟影響；5級(中抗)： 枝梗瘟，10 %～25 %谷粒受害；7級(感)： 多個(gè)枝?；蛑髦０l(fā)病，25 %～50 %谷粒受害；9級(高感)： 主枝梗或穗頸發(fā)病，超過50 %谷粒受害。

⑶病稈率( %)= 發(fā)病莖數(shù) / 調(diào)查總莖數(shù)×100。紋枯病分級標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)材料調(diào)查30莖，按表2記載每莖發(fā)病級別，計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.3 抗感級劃分 以3年中每個(gè)株系(材料)最高病級劃分該株系的抗(感)級(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 46個(gè)轉(zhuǎn)GO基因雜交后代田間抗感株系分布

從圖1可以看出，田間中抗-高抗稻瘟病的株系占46個(gè)供試株系的23.9 %，高感株系比例大，占50.0 %；中抗-抗紋枯病的株系占15.2 %，中感株系比例大，占52.2 %。說明多數(shù)供試的轉(zhuǎn)GO基因雜交后代不抗稻瘟病和紋枯病，田間表現(xiàn)抗2種病害的株系出現(xiàn)頻率較低，但中抗及其以上病級的抗稻瘟病的株系比抗紋枯病的株系多8.7 %。

表2 紋枯病抗性分級Table 2 Classification of resistance to rice sheath blight

2.2 各株系對稻瘟病及紋枯病的田間抗性表現(xiàn)

2.2.1 年度間相同株系的抗性差異 從表3可以看出，不抗的株系年度間田間抗感反應(yīng)變化較大，如株系J572，3年病穗率分別為56.1 %、5.0 %及40.0 %，病稈率分別為90.0 %、15.1 %及100 %；又如株系HR320，3年病穗率分別為4.3 %、11.2 %及85.0 %，病稈率88.9 %、20.0 %及80.0 %，2015年的發(fā)病程度明顯偏輕。但抗性較好株系年度間抗感反應(yīng)變化較小，如對稻瘟病高抗株系HR332，3年病穗率分別為5.0 %、2.3 %及4.8 %；對紋枯病抗的株系HR337，3年病稈率分別為9.0 %、45.3 %及20.0 %。上述結(jié)果表明，田間抗性鑒定主要受年度間發(fā)病程度差異影響較大，僅1年的鑒定結(jié)果可靠性較差。

2.2.2 株系間的抗性差異 從表3可以看出， 對稻瘟病達(dá)到高抗的株系2個(gè)(HR321及HR332)，抗的株系3個(gè)(J668、J670及HR324)，中抗株系6個(gè)(J618、J669、J779、J792、HR333及HR336)，感病株系12個(gè)，高感株系23個(gè)；對紋枯病達(dá)到抗的株系2個(gè)(HR337及HR339)，中抗株系5個(gè)(HR332、HR333、HR334、HR336及HR338)，中感株系24個(gè)，感病株系9個(gè)，高感株系6個(gè)。

圖1 46個(gè)轉(zhuǎn)GO基因雜交后代田間病級分布Fig.1 Distribution of rice blast and sheath blight disease grade of 46 transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene in the field

HR332既高抗稻瘟病，又中抗紋枯?。籋R333及HR336對稻瘟病和紋枯病均表現(xiàn)為中抗；HR321高抗稻瘟病，中感紋枯病；J668、J670及HR324抗稻瘟病，感紋枯?。籎618、J669、J779及J792中抗稻瘟病，也對紋枯病表現(xiàn)為感病。HR337及HR339抗紋枯病，但感或高感稻瘟??；HR334及HR338均中抗紋枯病，但高感稻瘟病。由此看出，①在46個(gè)轉(zhuǎn)GO基因雜交后代株系中，同時(shí)抗稻瘟病和紋枯病的株系很少，只抗1種病害的株系相對較多。②株系間由于其遺傳背景不同，對病菌侵染后的抗性反應(yīng)差異很大。

2.2.3 不同雜交組合間抗性株系比較 對不同雜交組合后代達(dá)中抗以上的株系進(jìn)行歸類(表4)，日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162、日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//樂恢188及日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//R473這3個(gè)組合后代出現(xiàn)了既抗稻瘟病又抗紋枯病的株系；日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//縉恢21后代出現(xiàn)只抗稻瘟病或抗紋枯病的株系；日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//明恢63及日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//H103這2個(gè)組合后代未出現(xiàn)抗紋枯病的株系。日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162陽性單株(F2)后代[14]，經(jīng)多代選擇穩(wěn)定的3個(gè)株系中，僅HR333既中抗稻瘟病又中抗紋枯病。

供試的5個(gè)親本中，明恢63、縉恢21、H103高感稻瘟病，樂恢188及R473感稻瘟病，其相應(yīng)雜交組合后代中出現(xiàn)了中抗至高抗的株系，稻瘟病抗性較親本有顯著提高。樂恢188本身中抗紋枯病，其余4個(gè)親本中感紋枯病，日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//樂恢188、日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//明恢63及日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//H103這3個(gè)組合的后代紋枯病抗性未有所提高；日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//縉恢21及日本晴(轉(zhuǎn)G)/蜀恢162//R473其后代出現(xiàn)紋枯病抗性水平明顯提高的株系。顯然，GO基因的表達(dá)受遺傳背景的影響，在不同遺傳背景中，調(diào)控水稻發(fā)生抗病反應(yīng)的程度也有較大差異。

表3 GO基因雜交后代對稻瘟病及紋枯病的田間抗性表現(xiàn)Table 3 Field resistance of transgenic rice filial generation with glucose oxidase gene to blast and sheath blight

續(xù)表3 Continued table 3

材料編號Material code年份Year葉瘟 Leaf blast穗頸瘟 Panicle neck blast紋枯病 Sheath blight病葉率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指數(shù)Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment病稈率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessmentJ659201358.858.840.029.3感S10091.1高感HS201525.02.837.125.543.912.72016--7.95.385.544.6J668201357.157.13.05.0抗R55.642.9中感MS201516.13.84.52.735.78.32016--6.35.970.037.8J669201339.039.03.02.0中抗MR20.017.1中感MS201520.05.011.58.330.76.72016--25.017.595.058.1J670201360.345.82.03.5抗R77.845.6中感MS201540.011.710.01.150.110.02016--8.34.460.520.7J688201378.752.810082.4高感HS50.038.9中感MS201515.02.865.115.020.63.32016--25.010.410045.0J715201358.936.32.02.0高感HS33.333.3中感MS201531.15.645.221.730.57.82016--93.548.610055.8J735201354.833.787.583.3高感HS62.562.5感S201520.63.380.030.035.25.02016--7.53.975.050.9J737201343.734.872.742.4高感HS100100高感HS201530.06.75.00.635.08.32016--10.25.960.327.9J779201331.725.015.010.7中抗MR10046.7中感MS20152.34.425.06.155.59.42016--10.56.795.050.9J792201351.335.814.312.2中抗MR100100高感HS201540.98.913.78.545.335.22016--14.113.210061.2J793201346.833.230.024.3感S10076.0感S201550.09.220.02.275.019.42016--10.213.560.131.6J794201352.6.33.64.55.1高感HS10064.4感S201542.111.125.917.450.515.62016--10064.810062.1J848201352.133.92.02.0高感HS40.040.0感S201544.511.332.316.123.716.12016--10074.710071.1HR320201341.932.04.32.4高感HS88.969.1感S

續(xù)表3 Continued table 3

材料編號Material code年份Year葉瘟 Leaf blast穗頸瘟 Panicle neck blast紋枯病 Sheath blight病葉率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指數(shù)Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment病稈率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment201515.03.911.27.420.02.22016--85.044.680.042.3HR321201344.234.02.02.0高抗HR81.342.2中感MS20155.00.64.72.815.13.92016--2.81.581.850.4HR323201323.515.942.934.9感S90.567.8感S201550.013.930.08.945.512.82016--34.723.180.140.5HR324201318.414.12.16.2抗R10064.4感S201515.03.33.62.333.219.72016--5.94.270.045.0HR325201343.525.610043.1高感HS72.365.6感S201541.210.615.03.940.15.62016--15.012.210057.6HR326201324.519.823.516.8高感HS40.018.9中感MS201545.610.610056.731.111.12016--22.316.785.048.3HR327201343.533.0.3.72.1高感HS16.67.2中感MS201562.522.210052.290.041.52016--45.034.775.427.5HR3282013----高感HS--中感MS201550.015.610056.522.32.32016--30.022.585.157.2HR329201340.026.011.07.8感S12.48.4中感MS201580.935.010.13.35.00.62016--31.518.075.344.6HR33020135.813.618.018.0感S9.03.0中感MS201585.127.250.013.335.511.72016--30.09.065.845.1HR331201349.438.97.53.4感S11.010.8中感MS201571.626.150.012.265.017.22016--15.04.165.055.2HR332201349.533.05.06.2高抗HR15.16.7中抗MR201535.111.12.35.410.13.32016--4.83.271.534.2HR333201318.614.412.511.1中抗MR13.04.2中抗MR201537.59.425.02.840.06.72016--25.015.850.026.1HR334201344.630.876.541.0高感HS30.122.0中抗MR201560.218.375.218.345.315.0

續(xù)表3 Continued table 3

材料編號Material code年份Year葉瘟 Leaf blast穗頸瘟 Panicle neck blast紋枯病 Sheath blight病葉率 ( %)Rate of diseased leaf 病情指數(shù)Diseaseindex病穗率 ( %)Rate of diseasedpanicles 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment病稈率 ( %)Rate of diseased stalk 病情指數(shù)Diseaseindex抗性評定Resistance assessment2016------HR335201350.028.910.66.7感S10074.3感S201585.031.150.012.275.442.82016--15.17.710.81.8HR336201352.132.48.45.5中抗MR40.732.0中抗MR201560.520.623.711.337.328.22016------HR337201357.140.395.082.0高感HS9.08.4抗R201585.328.910096.745.317.22016--10081.020.07.2HR338201342.128.39.310.3高感HS9.610.0中抗MR201535.010.665.147.225.05.02016--10079.245.623.9HR339201350.536.05.02.3感S48.65.0抗R201510035.630.011.07.24.82016--50.032.410.16.3HR340201377.358.818.511.9感S10093.3高感HS201555.015.622.830.520.02.22016--33.221.69.95.4LJH (CK1)201384.462.596.983.0高感HS88.922.3感S201585.153.671.367.567.849.52016--93.279.090.165.8Lemont (CK2)201350.220.747.523.8感S89.969.2高感HS201540.326.932.919.677.152.02016--29.420.010081.0明恢63Minghui63201344.237.858.325.3高感HS30.422.5中感MS201550.133.239.925.020.112.82016--40.831.455.943.0樂恢188Lehui188201327.917.243.130.0感S42.015.9中抗MR201532.424.031.112.922.825.42016--33.723.533.624.6縉恢21Jinhui21201342.525.255.229.4高感HS44.928.5中感MS201532.618.441.430.234.020.32016--45.122.755.544.7R473201326.811.641.228.3感S39.242.7中感MS201530.521.621.513.222.515.32016--29.421.049.723.9H103201349.230.250.227.1高感HS33.948.1中感MS201544.123.530.522.513.720.62016--21.518.248.133.6

Note: HR—High resistant；R—Resistant；MR—Middle resistant；MS—Middle Susceptible；S—Susceptible；HS—High susceptible. ‘-’mean lack of observation data.

Note: HR: High resistant；R: Resistant；MR: Middle resistant. ‘-’ mean lack of observation data.

3 討 論

前文[13]中，轉(zhuǎn)GO基因后代株系HR320和HR332對稻瘟病生理小種的抗病頻率>80 %，但HR320在2013年及2015年病圃中表現(xiàn)抗稻瘟病，但2016年病穗率達(dá)85 %，表現(xiàn)感病，而HR332在3年鑒定中均表現(xiàn)高抗，由此看出，僅憑1年抗譜測定結(jié)果或一年田間試驗(yàn)結(jié)果對一個(gè)材料的抗性尚不能做出準(zhǔn)確的判斷。經(jīng)抗譜測定結(jié)并合田間鑒定表明，HR332是一個(gè)新的高抗稻瘟病抗源材料。經(jīng)過3年觀察，遺傳背景不同的3個(gè)株系HR332、HR333及HR336對稻瘟病和紋枯病均有一定抗性(表3)。目前水稻中紋枯病的抗源很少[7-8]，本文中，HR337在3次田間鑒定中的紋枯病病指分別為8.4 %、17.2 %、及7.2 %，HR339分別為5.0 %、4.8 %及6.3 %，達(dá)到抗紋枯病的水平，可作為紋枯病抗源在育種中利用。

葡萄糖氧化酶存在于一些細(xì)菌和真菌中，專一催化β-D-葡萄糖氧化生成過氧化氫和葡萄糖酸。H2O2一方面能直接抑制和殺死病原菌，另一方面作為二級信使能激活和調(diào)控植物受病原菌侵染后引發(fā)的一系列防御反應(yīng)，如誘發(fā)植物膜脂過氧化形成抗性病斑，增強(qiáng)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)植保素合成等。由于不同寄主基因型與病原菌組合不同，產(chǎn)生防御反應(yīng)所啟動的信號傳導(dǎo)途徑就不同，導(dǎo)致不同遺傳背景寄主防御反應(yīng)的作用和表現(xiàn)特點(diǎn)也不同[14-19]。本文中，轉(zhuǎn)GO基因雜交后代出現(xiàn)既抗稻瘟病又抗紋枯病的株系，僅抗稻瘟病不抗紋枯病的株系，或僅抗紋枯病不抗稻瘟病的株系等多種類型的抗性表現(xiàn)(表3)，這為研究其抗病機(jī)制提供了新材料。

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