新型二維液相色譜法測定人血漿中阿立哌唑的濃度

劉宇，李林，王鋒

（1.云南省第一人民醫(yī)院，昆明市650032；2.湖南德米特儀器有限公司，長沙市410011；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長沙市410011）

精神分裂癥是一組慢性致殘性嚴(yán)重危害人類健康的精神疾病，大多數(shù)患者需要長期藥物治療，且是緩解患者癥狀與預(yù)防復(fù)發(fā)的最主要治療手段。阿立哌唑（Aripiprazole，APP）[1]是二氫喹啉酮類抗精神病藥，它在化學(xué)結(jié)構(gòu)式和藥理作用機(jī)制上均不同于其1、2 代抗精神病藥，是首個(gè)5-HT/多巴胺系統(tǒng)穩(wěn)定劑，不僅可以治療精神分裂癥的各種癥狀及改善認(rèn)知功能，并且較少引起錐體外系癥狀、糖脂代謝障礙等不良反應(yīng)，在維持治療中具有依從性好、生活滿意度提高、改善社會(huì)功能等優(yōu)勢，目前已成為治療精神分裂癥的一線藥物。美國FDA于 2002 年 11月 15日正式批準(zhǔn)用于治療精神分裂癥。2003年歐洲醫(yī)藥評估組織獲準(zhǔn)該藥用于臨床。2004 年底國內(nèi)開始正式使用[2]。體外研究[3]表明，APP主要通過細(xì)胞色素CYP2D6和CYP3A4代謝，該酶的多態(tài)性可能是導(dǎo)致藥物個(gè)體差異的主要原因，因此有必要檢測其血藥濃度，為個(gè)體化給藥提供依據(jù)。

目前文獻(xiàn)報(bào)道測定體內(nèi)APP濃度的方法較多，有高效液相色譜法( HPLC) 、高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS) 和高效液相串聯(lián)電噴霧離子化質(zhì)譜法（HPLC-MS /ESI）。若采用常規(guī)液相色譜，極易堵塞色譜柱，因此對血樣純化的要求較高，而血樣在處理過程中由于涉及復(fù)雜的固液轉(zhuǎn)移或液液轉(zhuǎn)移等多步操作，對實(shí)驗(yàn)操作者要求較高，使得操作過程難以控制，不利于臨床樣品監(jiān)測。本文采用2D-LC-UV，它的優(yōu)勢在于對血樣進(jìn)行富集、轉(zhuǎn)移和分離，剔除了大量雜質(zhì)，提高了分離能力，減少了其他干擾，達(dá)到快速分離的目的。對于測定人血漿中APP的濃度簡便、快速、可行，適合用于臨床血藥濃度的常規(guī)監(jiān)測。

1 材料

1.1 儀器

儀器 2D-LC-UV 系統(tǒng)為 ANAX-島津公司FLC2801 全自動(dòng)二維液相色譜系統(tǒng)，第一維色譜系統(tǒng)(LC1) 為 ANAX 公司 FLC-2801( ANAX，湖南德米特儀器有限公司)，第二維色譜系統(tǒng)( LC2) 為島津LC-20A 液相色譜(島津公司，日本)構(gòu)成，包括2個(gè)LC-20ATvp高壓輸液泵，LC-20ATvp 四元低壓色譜泵，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD- 20Avp 檢測器。第一維色譜柱主要負(fù)責(zé)樣品預(yù)分離，第二維色譜柱主要負(fù)責(zé)樣品的分離監(jiān)測，中間接口以中間柱為“橋梁”采用“同向中心切割”的柱柱轉(zhuǎn)換模式。GH-202 電子分析天平( AND 公司，日本) ，HS145型離心機(jī)（長沙安萊科分析儀器有限公司），XW-80A旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

APP對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100657-200401，純度＞ 99%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國ACS公司），磷酸銨、（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；馬血清（北京政博偉業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)：160128）

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液配制

精密稱取APP對照品1.0mg于10mL容量瓶中，用適量50%異丙醇溶解后再加50%異丙醇定容至刻度，混勻，即得濃度為100μg·mL-1的APP標(biāo)準(zhǔn)溶液。放置于冰箱 4℃避光保存，使用時(shí)用50%異丙醇稀釋至所需濃度。

2.1.2 質(zhì)控樣品的配制

精密吸取適量不同濃度APP對照品溶液，分別加入10mL容量瓶，用50%異丙醇定容至刻度，混勻，配制成220.6、441.2、882.3ng·mL-1的低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品。

2.2 血樣處理

精密量取0.4mL血漿于EP管中，加入乙腈1mL，渦旋震蕩1min，14500r/min離心8min，取上清1mL加入1.5mL進(jìn)樣瓶中，搖勻，進(jìn)樣300μL。

2.3 定量方法

采用外標(biāo)工作曲線法定量，將APP樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得濃度。每批隨行測定高、中、低質(zhì)控樣品。

2.4 色譜條件

LC1系統(tǒng)中一維液相色譜柱為AstonSX1（4.6 mm× 25 mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈：甲醇：20mmol/L磷酸銨=20:10:18（V/V/V），用磷酸調(diào)PH至6.5，中間色譜柱AstonSCB（4.6 mm×10 mm，5 μm），LC2系統(tǒng)中二維色譜柱為AstonSCB（4.6 mm×50 mm，5μm），流動(dòng)相為堿：酸：甲醇：乙腈=8:29:15：48（V/V/V/V）。柱溫40℃，檢測波長252nm，流速1.2ml/min，進(jìn)樣體積300μL。FLC2420系統(tǒng)是通過3個(gè)工序流程進(jìn)行目標(biāo)組分APP的二維分離，其中工序1是樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，在一維色譜柱進(jìn)行初步分離，工序2為樣品中目標(biāo)組分APP轉(zhuǎn)移至中間柱中，工序3是中間柱中的目標(biāo)組分在二維流動(dòng)相淋洗下進(jìn)一步分離，被后端UV檢測器檢測。見圖1。其系統(tǒng)運(yùn)行程序見表1。

2.5 色譜行為和方法專屬性

在“2.4”項(xiàng)下色譜條件，APP色譜峰的總體運(yùn)行時(shí)間為8.50min，保留時(shí)間為5.3min左右，其中第一維

圖1 FLC 2420二維液相色譜分離檢測工序

工序與捕獲工序占有1.83min，而第二維分離時(shí)間卻可達(dá)到5.7min，這就是由于2D-LC-UV系統(tǒng)有別于其他HPLC的優(yōu)勢，可以同時(shí)進(jìn)行在線分離和進(jìn)樣，減少了中間環(huán)節(jié)，且色譜峰在此時(shí)間段內(nèi)無干擾峰及其他干擾。見圖2。

表1 FLC2420二維液相色譜系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)間程序

圖2 阿立哌唑2D-LC-UV色譜圖

A 空白血漿（blank plasma）

B對照品溶液（reference 551.5ng·mL-1）

C對照品+空白血漿（blank plasma spiked with reference ，441.2 ng·mL-1）

D 血樣（blood sample，491.3 ng·mL-1）

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

使用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成濃度分別為68.9、137.9、275.7、551.5、1102.9ng·mL-1的APP標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“2.2”項(xiàng)下方法操作處理、“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以濃度為自變量（X），峰面積為因變量（Y）作回歸計(jì)算，APP在68.9～1102.9ng·mL-1呈良好線性關(guān)系，回歸方程為：

2.8 絕對回收率

精密量取220.6、441.2、882.3ng·mL-1的低、中、高三個(gè)濃度的APP質(zhì)控樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法操作處理、“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。與對應(yīng)濃度的APP對照品工作液峰面積進(jìn)行比較，平行3組。結(jié)果低、中、高3個(gè)濃度處理樣品的絕對回收率為96.1%、98.2%、94.8%。表明絕對回收率高且穩(wěn)定。

2.9 精密度與準(zhǔn)確性

精密量取220.6、441.2、882.3ng·mL-1的低、中、高三個(gè)濃度的APP質(zhì)控樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法操作處理、“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。1天測定5次，連續(xù)測定5天，計(jì)算APP的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確性，結(jié)果見表2。

2.10 穩(wěn)定性考察

表2 日內(nèi)、日間精密度與準(zhǔn)確度

取低、中、高3個(gè)濃度的APP質(zhì)控樣品，分別在室溫條件下放置 0 、2、4、8、12小時(shí)，反復(fù)凍融2次，-20 ℃冰箱中保存 0、5、10、20、30天后，按“2.2”項(xiàng)下方法操作處理、“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果各濃度水平測定值的 RSD 值均小于7.9 %。表明，在此實(shí)驗(yàn)條件下血漿中的APP穩(wěn)定性良好。

3 討論

臨床實(shí)際應(yīng)用中，某些藥物治療指數(shù)低、安全范圍窄、服藥周期長、體內(nèi)過程和療效存在較大個(gè)體差異，特別是與其他藥物聯(lián)用，藥物間由于存在相互作用從而導(dǎo)致體內(nèi)血藥濃度與單用比差異較大，進(jìn)而影響臨床療效，醫(yī)師僅憑自身經(jīng)驗(yàn)用藥往往難以控制病情，為此有必要對這些藥物用藥后的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測，尤其是對需要長期進(jìn)行藥物治療以緩解癥狀與預(yù)防復(fù)發(fā)的精神類藥物。阿立哌唑主要用于精神分裂癥患者，但資料顯示[3]阿立哌唑血藥濃度差異性較大，呈非正態(tài)分布，這可能與藥物代謝的個(gè)體差異有關(guān)，為此對其體內(nèi)濃度進(jìn)行監(jiān)測很有必要，以便及時(shí)調(diào)整給藥劑量，保證臨床用藥安全、合理、有效。

目前血樣前處理、進(jìn)樣體積小、干擾物質(zhì)多、靈敏度低及出峰時(shí)間長一直是困擾體內(nèi)藥物濃度監(jiān)測的難點(diǎn)，也是誤差引入和耗時(shí)過長的主要原因。新型二維液相色譜結(jié)合紫外線檢測系統(tǒng)（2D-LC-UV）的引入從不同層面解決了這一問題。2D-LC-UV不同于已有文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，共使用了3根色譜柱，一維色譜柱即萃取柱負(fù)責(zé)血樣的在線富集及初步分離，中間色譜柱負(fù)責(zé)對血樣進(jìn)行捕獲及運(yùn)送，二維色譜柱即分析柱負(fù)責(zé)血樣的進(jìn)一步分離。它的優(yōu)勢在于對血樣進(jìn)行富集、轉(zhuǎn)移和分離，剔除了大量雜質(zhì)，提高了分離能力，減少了其他干擾，達(dá)到快速分離。

一般而言，樣品在進(jìn)樣前均需采用有機(jī)溶劑或酸、堿等進(jìn)行處理，且進(jìn)樣量體積小，為10～20μL[4]。而本法采用乙腈沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，進(jìn)樣量達(dá)到300 μL，比普通的檢測分析方法快速且進(jìn)樣量高出10～20倍，采用大體積進(jìn)樣，提高了絕對進(jìn)樣量，檢測靈敏度完全滿足臨床需要，因此大大減小了進(jìn)樣偏差，即使采用外標(biāo)法也可以獲得良好準(zhǔn)確性及精密度。輔助聚焦體系通過在特定時(shí)間改變流動(dòng)相的比例使得藥物呈點(diǎn)狀進(jìn)入色譜柱，消除大體積進(jìn)樣時(shí)藥物分散引起的擴(kuò)散誤差。是因?yàn)楸鞠到y(tǒng)中具備在線聚焦體系和在線過濾機(jī)清洗裝置，能克服目標(biāo)物傳遞的非正態(tài)性擴(kuò)散和色譜柱易堵塞的問題，保證色譜峰形對稱以及提高抗堵塞能力，彌補(bǔ)了液液萃取易乳化、易污染和回收率不高的缺陷，從而具備高靈敏度以及良好的可定量性和耐受性[5]。因此對分析人體血漿及其他復(fù)雜生物樣本具有強(qiáng)大的去干擾能力。

另外，本試驗(yàn)方法與以往的二維液相色譜的另一不同之處在于使用了中間柱作為橋梁來連接一維色譜柱和二維色譜柱，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物有效轉(zhuǎn)移的同時(shí)也減小了兩根長柱直接連接壓力過高造成的色譜柱和儀器損傷，且中間柱的加入能夠減小二維色譜法流動(dòng)相兼容問題[5]。

在本試驗(yàn)色譜條件下，一個(gè)樣本從前處理、色譜分離到待測目標(biāo)物檢測分析僅需20-30min，具有分析速度快、自動(dòng)化程度高、重復(fù)性與精密度以及準(zhǔn)確度好的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對阿立哌唑的在線分離及分析檢測。

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