廣州地區(qū)中老年男性RANK/RANKL/OPG和WNT信號通路基因多態(tài)性與髖部骨強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)分析

王希丹,肖蘇妹,陳裕明

(中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,中國廣東廣州510080)

骨質(zhì)疏松是中老年人群中一種常見的慢性疾病,可導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低和骨折風(fēng)險顯著增加[1]。目前,針對骨質(zhì)疏松的研究中,骨密度(bone mineral density,BMD)是最常用的研究表型,它主要體現(xiàn)影響骨強(qiáng)度的骨量。但是越來越多的證據(jù)顯示,骨強(qiáng)度的另一個決定因素,即反映骨骼質(zhì)量的骨幾何結(jié)構(gòu),對骨質(zhì)疏松也具有獨立影響[2]。相比于BMD,BMD結(jié)合骨幾何結(jié)構(gòu)可以更好地預(yù)測骨折風(fēng)險[3]。骨質(zhì)疏松有較強(qiáng)的遺傳決定性,遺傳率在0.50到0.85之間[4]。現(xiàn)有研究顯示,RANK/RANKL/OPG信號通路在調(diào)節(jié)骨重建方面具有不可忽視的功能[5],WNT信號通路不僅能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)骨沉積,而且還能調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和功能[6],它們是骨代謝中兩條重要的信號通路。全基因組關(guān)聯(lián)研究和大型薈萃分析發(fā)現(xiàn),位于這兩條信號通路中的基因與BMD顯著相關(guān)[7]。然而,這些研究多以歐洲人群以及絕經(jīng)后女性為研究對象。有研究提出遺傳因素對骨質(zhì)疏松的影響可能存在種族和性別差異[8]。目前,在中國男性人群中的相關(guān)研究相對較少,特別是對骨幾何結(jié)構(gòu)的影響并不清楚。因此,本研究探討了位于RANK/RANKL/OPG和WNT信號通路中6個基因的10個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly-morphism,SNP)位點與中國廣州中老年男性人群髖部BMD和骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)的關(guān)聯(lián),為全面理解骨強(qiáng)度的影響因素以及有效防治骨質(zhì)疏松提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究人群來自于中山大學(xué)5010項目之一的廣州營養(yǎng)健康研究隊列[9],該隊列建立于2008年,每3年進(jìn)行一次隨訪,主要用于研究骨質(zhì)疏松和心血管相關(guān)疾病。研究對象招募于廣州市越秀區(qū)農(nóng)林社區(qū)。納入標(biāo)準(zhǔn)為:40歲以上,且在廣州本地居住超過5年的男性志愿者。排除標(biāo)準(zhǔn)包括:1)曾患/現(xiàn)患影響骨、鈣代謝的相關(guān)疾病,如骨代謝障礙,或一些慢性內(nèi)分泌疾病如甲亢、甲旁亢等,以及有重大胃腸手術(shù)史;2)曾經(jīng)/現(xiàn)在服用影響骨、鈣代謝的藥物,如磷酸鹽、降鈣素、活性維生素D3代謝物等;3)存在影響本研究骨表型測量的因素,如左側(cè)髖部骨折等。本研究選取該隊列2011年第一次隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行橫斷面研究,共有788名滿足納入排除標(biāo)準(zhǔn)的男性進(jìn)入分析。本研究獲得了所有研究對象的書面知情同意,并且通過了中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨表型的測定

本研究采用美國Hologic公司生產(chǎn)的HO LOGIC Discovery-W型號雙能X線吸收儀(dualenergy X-ray absorptiometry,DXA)檢測研究對象左側(cè)髖部BMD(g/cm2),并且應(yīng)用儀器自帶的APEX 3.2程序?qū)y部掃描片中股骨頸進(jìn)行測量和分析,得到以下骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù):1)橫截面積(cross-sectional area,CSA,cm2):除去軟組織和骨小梁后骨的橫截面積;2)平均皮質(zhì)厚度(average cortical thickness,ACT,cm):骨內(nèi)徑和外徑之差的二分之一;3)剖面模數(shù)(section modulus,SM,cm3):反映了骨骼承受最大側(cè)面壓力時的抗彎曲強(qiáng)度;4)抗屈曲率(buckling ratio,BR):評價骨骼屈曲時皮質(zhì)的穩(wěn)定性。BMD、CSA、ACT、SM 越大,BR 越小,則骨強(qiáng)度越大。以上各項骨表型指標(biāo)的變異系數(shù)分別是:BMD,1.92%;CSA,1.55%;ACT,2.19%;SM,2.99%;BR,4.62%。

1.2.2 SNP位點基因分型

取研究對象外周血3 mL,采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的DP318-03型號血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞DNA。本研究選取了全基因組關(guān)聯(lián)研究或薈萃分析中報道的與BMD顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點,同時參考千人基因組計劃中國人群的數(shù)據(jù)(http://browser.1000genomes.org/),當(dāng)多個SNP位點存在連鎖不平衡(r2＞0.8)時僅取其中一個SNP進(jìn)行分析,最終選擇了位于RANK/RANKL/OPG和WNT信號通路中的6個基因的10個SNP位點,即RANK/RANKL/OPG信號通路:骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)基因中的 rs2073617、rs2073618、rs3134069,核因子 Kappa-B受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B,RANK)基因中的rs3018362,核因子Kappa-B受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)基因中的rs9594738;WNT信號通路:低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relat-ed protein5,LRP5)基因中的 rs3736228、rs491347,WNT16基因中的rs3801387以及硬骨素(sclerostin,SOST)基因中的rs1107748和rs1513670。采用美國SEQUENOM公司MassArray時間飛行質(zhì)譜技術(shù)完成樣品SNP位點的基因分型。其中,基因分型成功率低于95%,次等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)小于5%或基因型分布不滿足哈-溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)檢驗(P＜0.05)的SNP位點則被剔除。

1.2.3 混雜因素的測量

本研究由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員利用問卷形式對研究對象的基本信息、疾病史、用藥史、生活飲食習(xí)慣(如吸煙、飲酒等)以及體力活動進(jìn)行面對面詢問并記錄。研究中將每天至少吸一支煙且累計超過6個月和每周至少飲酒一次且累計超過6個月分別定義為有吸煙和飲酒習(xí)慣。體力活動評價是基于一份19項的問卷調(diào)查,計算每天各種體力活動的代謝當(dāng)量(metabolic equivalent,MET)時間加權(quán)的總和(MET·h/d)。此外,每位研究對象的身高(cm)、體重(kg)以及體重指數(shù)(body mass index,BMI,kg/m2)均采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測量和計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進(jìn)行研究對象基本資料統(tǒng)計描述。本研究的定量資料均滿足正態(tài)分布,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)進(jìn)行描述,定性資料用頻數(shù)(n)和頻率(%)進(jìn)行描述。SNP位點的質(zhì)量檢測及其與骨表型的關(guān)聯(lián)分析,以及基因-基因交互作用分析均采用PLINK 1.07軟件(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink)進(jìn)行。采用加性模型下的多重線性回歸分析所檢測SNP位點與骨表型的關(guān)聯(lián),次等位基因為效應(yīng)等位基因,校正的混雜因素包括年齡、身高、體重、吸煙、飲酒以及體力活動。由于本研究是根據(jù)已報道的與BMD顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點進(jìn)行驗證研究,因此在SNP位點的關(guān)聯(lián)分析中認(rèn)為單側(cè)檢驗P＜0.05,且關(guān)聯(lián)方向與已報道的研究中方向一致則具有統(tǒng)計學(xué)意義。基因-基因交互作用采用相乘模型進(jìn)行分析,應(yīng)用Bonferroni法進(jìn)行多重檢驗校正。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本情況

本研究中788名男性的基本情況見表1。研究對象的平均年齡和BMI分別是62.240±5.893歲和24.076±3.026 kg/m2。吸煙人數(shù)為386人,占總?cè)巳旱?8.985%。有飲酒習(xí)慣的共有125人,占總?cè)巳旱?5.863%。股骨頸BMD、CSA、ACT、SM以及BR的均值(標(biāo)準(zhǔn)差)分別為:0.749(0.112)g/cm2,3.062(0.479)cm2,0.180(0.030)cm,1.622(0.313)cm3,10.997(2.362)。

表1 研究對象的一般情況(n=788)Table1 Basic characteristics of the studied samples(n=788)

2.2 SNP位點基本情況

本研究共基因分型了兩條通路中6個基因的10個SNP位點。檢測結(jié)果顯示788人的10個SNP位點的基因型檢出率均為100%。此外,所有SNP位點在研究人群中的MAF均大于5%,并且基因型分布均符合HWE(P＞0.05)。這些SNP位點的基本情況見表2。

2.3 SNP位點與骨表型關(guān)聯(lián)分析

SNP位點與骨表型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3。在校正混雜因素年齡、身高、體重、吸煙、飲酒和體力活動后,RANK/RANKL/OPG信號通路中OPG基因SNP位點rs3134069的次等位基因C與BMD和ACT呈負(fù)向關(guān)聯(lián)(BMD:β=-0.017,P=0.024;ACT:β=-0.004,P=0.040),RANK基因中rs3018362的次等位基因G與BR呈臨界性正相關(guān)(β=0.204,P=0.070)。WNT信號通路中,攜帶LRP5基因中rs3736228次等位基因T的人群相對于攜帶C等位基因的人群具有更低的BMD(β=-0.016,P=0.009)、CSA(β=-0.050,P=0.021)、ACT(β=-0.003,P=0.024)和較高的BR(β=0.242,P=0.043)。同時,LRP5基因中rs491347的次等位基因G亦與BMD呈顯著負(fù)向關(guān)聯(lián)(β=-0.012,P=0.046),與CSA和ACT呈臨界性負(fù)向關(guān)聯(lián)(CSA:β=-0.040,P=0.053;ACT:β=-0.003,P=0.066)。本研究中,其他6個SNP位點與骨表型的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),但其中位于OPG基因的rs2073617和SOST基因的rs1513670對BMD以及各個骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響均與已報道研究中的關(guān)聯(lián)方向一致。

表2 SNP位點的基本情況Table2 The characteristics of genotyped SNPs

2.4 基因-基因交互作用

本研究針對兩個信號通路的6個基因,以研究骨表型為基礎(chǔ)進(jìn)行了基因-基因交互作用分析,結(jié)果見表4。在調(diào)整了年齡、身高、體重、吸煙、飲酒以及體力活動的影響后,結(jié)果提示:位于RANK/RANKL/OPG信號通路中的OPG與RANK、OPG與RANKL對BMD和各骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)具有交互作用(P＜0.05);位于WNT信號通路中的LRP5與SOST、LRP5與WNT16對BMD和ACT具有交互作用(P＜0.05)。不同基因間SNP的兩兩交互作用共進(jìn)行了40次檢測,采用Bonferroni法校正多重檢驗后,這些交互作用未顯示出統(tǒng)計學(xué)意義(P＞1.25×10-3)。此外,本研究中未檢測到兩條信號通路之間的基因?qū)潜硇陀酗@著交互作用(P＞0.05)。

表3 SNP位點與骨表型的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(n=788)Table3 Association results of SNPs with bone phenotypes(n=788)

表4 基因-基因交互作用關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(n=788)Table4 Results of gene-gene interaction analysis(n=788)

3 討論

本研究探討了既往全基因組關(guān)聯(lián)研究以及大型薈萃分析中已報道的位于RANK/RANKL/OPG和WNT信號通路中和BMD相關(guān)的6個基因與中國廣州中老年男性人群髖部BMD以及骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)的關(guān)系。研究結(jié)果顯示,在校正了年齡、身高、體重、吸煙、飲酒和體力活動的混雜作用之后,RANK/RANKL/OPG信號通路中的OPG基因以及WNT信號通路中的LRP5基因的SNP位點與BMD以及骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。

RANK/RANKL/OPG信號通路由RANK、RANKL和OPG3個基因組成。RANK基因表達(dá)在破骨細(xì)胞表面,而RANKL基因表達(dá)于成骨細(xì)胞表面,RANKL與RANK結(jié)合可以提高破骨細(xì)胞分化效率,促進(jìn)骨吸收[10]。OPG與RANK結(jié)構(gòu)相似,能夠與RANK競爭結(jié)合RANKL,從而抑制破骨細(xì)胞的分化及活化,誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞的凋亡,阻礙骨質(zhì)吸收[11]。目前,有關(guān)OPG基因中SNP位點rs3134069的研究多以絕經(jīng)后女性為研究對象,本研究中檢測到該位點的次等位基因C與中國中老年男性BMD和ACT呈顯著負(fù)相關(guān),與既往絕經(jīng)后女性人群的研究結(jié)果[12]相同。SNP位點rs3134069位于OPG基因啟動子區(qū)域,其等位基因從A突變成C,C與其之后的G進(jìn)一步形成CpG雙核苷酸序列,CpG會使該區(qū)域甲基化程度增加,可能因此導(dǎo)致了該基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降,從而降低了OPG蛋白的表達(dá)水平,增加了骨質(zhì)疏松的易感性。OPG基因中另一個SNP位點rs2073617與BMD以及骨幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)的負(fù)相關(guān)在本研究中雖未能達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義,但是其對本研究中5個骨表型的影響具有內(nèi)部一致性,且與既往報道的關(guān)聯(lián)方向[13]一致。本研究中位于RANK基因的rs3018362的G等位基因?qū)MD以及骨幾何結(jié)構(gòu)的作用都傾向于消極影響,該結(jié)果與既往歐洲人群薈萃分析提出的G等位基因是骨質(zhì)疏松保護(hù)因素的結(jié)論[14]相悖。但是該薈萃分析納入的人群主要是歐洲人群,而該SNP在歐洲人群和亞洲人群的基因型分布頻率有較大差異,千人基因組計劃中的數(shù)據(jù)顯示,亞洲人群中的次等位基因G在歐洲人群中的頻率高達(dá)0.636。同時,在既往中國人群中的研究顯示,該SNP位點的G等位基因是骨質(zhì)疏松的風(fēng)險等位基因[15],結(jié)果與本研究相同。由此可見,目前有關(guān)RANK基因rs3018362位點與亞洲人群骨健康的關(guān)系值得我們進(jìn)行更深入的研究。

WNT信號通路中,WNT蛋白的配體與細(xì)胞表面相應(yīng)的受體結(jié)合,活化一系列復(fù)雜的生物通路,包括β-catenin依賴的經(jīng)典信號途徑以及非β-catenin依賴的信號途徑。本研究主要針對其中的LRP5、SOST和WNT16三個基因展開分析。LRP5蛋白參與了經(jīng)典WNT/β-catenin途徑,作為輔助受體與WNT蛋白以及FZD蛋白家族受體結(jié)合,激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)β-catenin向核內(nèi)轉(zhuǎn)運,參與下游靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),促進(jìn)成骨細(xì)胞前體的增殖分化,抑制成骨細(xì)胞的凋亡,從而調(diào)節(jié)骨量[16]。LRP5基因中rs3736228的次等位基因T在關(guān)聯(lián)分析中與BMD、CSA、ACT的下降以及BR的上升呈現(xiàn)顯著相關(guān),這與既往的BMD全基因組關(guān)聯(lián)研究的薈萃分析結(jié)果[7]一致。此外,LRP5基因中rs491347的G等位基因在本研究人群中觀察到與BMD具有負(fù)相關(guān),并與CSA和ACT也顯示出臨界性負(fù)向關(guān)聯(lián),這與Xiong等[17]在733名中國人以及1 873名白人研究對象中發(fā)現(xiàn)的該SNP的G等位基因與腰椎低BMD顯著相關(guān)的結(jié)論一致。根據(jù)哈佛大學(xué)的Genetic Power Calculator軟件計算,本研究的樣本量已經(jīng)具有約80%的統(tǒng)計功效,能夠檢測到約1.2%的遺傳效應(yīng),然而本研究針對SOST基因與WNT16基因SNP位點進(jìn)行的分析卻未能檢測到其與骨表型存在有統(tǒng)計學(xué)意義的關(guān)聯(lián),這可能是因為這些SNP位點的效應(yīng)較小,本研究的樣本量還不足以檢測到效應(yīng)較小的遺傳位點。但是位于SOST基因的rs1513670位點在本研究所研究表型中都趨向于是骨強(qiáng)度的危險因素,與既往的全基因組關(guān)聯(lián)研究所得的關(guān)聯(lián)方向[18]一致。

本研究中有些基因SNP位點的檢測結(jié)果與既往研究不完全相同,這可能是由于骨質(zhì)疏松是一個由多因素決定的疾病。盡管我們在納入年齡、身高、體重這些常見混雜因素的同時,還考慮到生活習(xí)慣如吸煙、飲酒以及體力活動的影響。然而,目前已有研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)攝入等其他環(huán)境因素以及環(huán)境與基因之間交互作用也會影響骨骼的密度和結(jié)構(gòu)[19]。因此,這些易感基因?qū)χ袊巳汗琴|(zhì)疏松的影響有待進(jìn)一步探討。

綜上所述,本研究支持了OPG基因和LRP5基因與中國中老年男性人群髖部骨強(qiáng)度相關(guān)的結(jié)論。

參考文獻(xiàn)(References):

[1]Cummings S R,Melton L J.Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures[J].The Lancet,2002,359(9319):1761-1767.

[2]LaCroix A Z,Beck T J,Cauley J A,et al.Hip structural geometry and incidence of hip fracture in postmenopausal women:what does it add to conventional bone mineral density?[J].Osteoporosis International,2010,21(6):919-929.

[3]Leslie W D,Pahlavan P S,Tsang J F,et al.Prediction of hip and other osteoporotic fractures from hip geometry in a large clinical cohort[J].Osteoporosis International,2009,20(10):1767-1774.

[4]Ozbas H,Tutgun O S,Ozdamar K.Genetic and environmental factorsinhumanosteoporosis[J].MolecularBiologyReports,2012,39(12):11289-11296.

[5]Trouvin AP,Goeb V.Receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin:maintaining the balance to prevent boneloss[J].Clinical Interventions in Aging,2010,5:345-354.

[6]Regard J B,Zhong Z,Williams B O,et al.Wnt signaling in bone development and disease:making stronger bone with Wnts[J].ColdSpringHarborPerspectivesinBiology,2012,4(12):a007997.

[7]Estrada K,Styrkarsdottir U,Evangelou E,et al.Genome-wide meta-analysis identifies 56 bone mineral density loci and reveals 14 loci associated with risk of fracture[J].Nature Genetics,2012,44(5):491-501.

[8]Zhang F,Tan L J,Lei S F,et al.The differences of femoral neck geometric parameters:effects of age,gender and race[J].Osteoporosis International,2010,21(7):1205-1214.

[9]Zhang Z Q,He L P,Liu Y H,et al.Association between dietary intake of flavonoid and bone mineral density in middle aged and elderly Chinese women and men[J].Osteoporosis International,2014,25(10):2417-2425.

[10]Mencej-Bedrac S,Prezelj J,Marc J.TNFRSF11Bgene polymorphisms 1181G＞C and 245T＞G as well as haplotype CT influence bone mineral density in postmenopausal women[J].Maturitas,2011,69(3):263-267.

[11]Wada T,Nakashima T,Hiroshi N,et al.RANKL-RANK signaling in osteoclastogenesis and bonedisease[J].Trends in Molecular Medicine,2006,12(1):17-25.

[12]Boronova I,Bernasovska J,Macekova S,et al.TNFRSF11B gene polymorphisms,bone mineral density,and fractures in Slovak postmenopausal women[J].Journal of Applied Genetics,2015,56(1):57-63.

[13]Wang C,Zhang Z,Zhang H,et al.Susceptibility genes for osteoporotic fracture in postmenopausal Chinese women[J].Journal of Bone and Mineral Research,2012,27(12):2582-2591.

[14]Kemp J P,Sayers A,Paternoster L,et al.Does bone resorption stimulate periosteal expansion?A cross-sectional analysis ofβ-C-telopeptides of typeⅠcollagen(CTX),genetic markers of the RANKL pathway,and periosteal circumference as measured by pQCT[J].Journal of Bone and Mineral Research,2014,29(4):1015-1024.

[15]Shang M,Lin L,Cui H.Association of genetic polymorphisms of RANK,RANKL and OPG with bone mineral density in Chinese peri-and post-menopausal women[J].Clinical Biochemistry,2013,46(15):1493-1501.

[16]Lerner U H,Ohlsson C.The WNT system:background and its role inbone[J].JournalofInternalMedicine,2015,277(6):630-649.

[17]Xiong D H,Lei S F,Yang F,et al.Low-density lipoprotein receptor-related protein 5(LRP5)gene polymorphisms are associated with bone mass in both Chinese and whites[J].Journal of Bone and Mineral Research,2007,22(3):385-393.

[18]Styrkarsdottir U,Halldorsson B V,Gretarsdottir S,et al.New sequence variants associated with bone mineral density[J].Nature Genetics,2009,41(1):15-17.

[19]Crabtree N,Lunt M,Holt G,et al.Hip geometry,bone mineral distribution,and bone strength in European men and women:the EPOS study[J].Bone,2000,27(1):151-159.