秀麗隱桿線蟲(chóng)在神經(jīng)退行性疾病研究中的應(yīng)用

凌 偉,王雅麗,吳德玲,王桐生,張 偉,梁德勤,李 正,許雙旺

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)安徽合肥230012)

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases,NDs)是典型的由漸進(jìn)性神經(jīng)功能障礙和特定神經(jīng)通路結(jié)構(gòu)及功能的喪失而導(dǎo)致的行為癥狀。近年,有關(guān)NDs包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等疾病中分子生物學(xué)研究和一些致病突變因子的鑒定技術(shù)不斷成熟,但全球數(shù)百萬(wàn)人的痛苦和社會(huì)巨大的負(fù)擔(dān)并沒(méi)有得到很好的緩解。隨著年齡的增長(zhǎng),人們患病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)迅速增加[1],而中國(guó)正處于老齡化人口迅速增長(zhǎng)的階段,這使得NDs成為更多醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。NDs可以由遺傳引起(如亨廷頓病),但在大多數(shù)情況下具有散發(fā)性的發(fā)病特點(diǎn)(如阿爾茨海默病和帕金森病)。其發(fā)病的機(jī)制通常包括蛋白質(zhì)異常磷酸化、蛋白質(zhì)棕櫚化、致病蛋白質(zhì)的乙?；饔谩⒌鞍踪|(zhì)錯(cuò)誤折疊、缺乏泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)、自噬清除致病蛋白質(zhì)能力降低、RNA代謝改變、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、軸突運(yùn)輸中斷、神經(jīng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活等[2,3]。

迄今為止,關(guān)于NDs的研究進(jìn)展緩慢,其中一個(gè)重要原因就是缺乏合適的疾病動(dòng)物模型。嚙齒類動(dòng)物模型不能完全模擬NDs的病理特征和疾病發(fā)展過(guò)程,并且有研究者發(fā)現(xiàn)許多藥物在嚙齒類模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有良好治療效果,但在臨床測(cè)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)無(wú)效,這在一定程度上說(shuō)明嚙齒類動(dòng)物作為NDs模型可能存在重大的缺陷[4]。與人類更為接近的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型,卻存在著生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、基因操作困難、費(fèi)用高昂等缺陷,難以被廣泛應(yīng)用。因此,為了尋找治療NDs的有效方法,有研究者采用多種動(dòng)物模型來(lái)篩選藥物。目前,關(guān)于NDs的致病基因及其調(diào)節(jié)因子遺傳變異的原因尚未完全闡明,而秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans),這一模式生物,在解決這些問(wèn)題以及NDs相關(guān)研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)通常生活在20℃的環(huán)境中,幼蟲(chóng)經(jīng)歷3.5 d生長(zhǎng)為成蟲(chóng),在正常情況下,其生命周期為3周左右。當(dāng)族群擁擠或食物不足時(shí),會(huì)進(jìn)入另一種幼蟲(chóng)期,叫做dauer幼蟲(chóng),進(jìn)入這個(gè)時(shí)期的線蟲(chóng)可存活數(shù)月之久。以秀麗隱桿線蟲(chóng)作為模型研究神經(jīng)退行性疾病有諸多優(yōu)點(diǎn)。其一,在秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組中,大約有42%的基因與人類疾病存在相關(guān)性。許多由遺傳因素引起的人類疾病能夠在線蟲(chóng)中找到相應(yīng)的同源染色體,一些重要的基因只有單個(gè)位點(diǎn),從而方便我們進(jìn)行機(jī)理的研究;其二,秀麗隱桿線蟲(chóng)體積小,生命周期短,易于在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng),其成蟲(chóng)長(zhǎng)度只有1 mm左右,在100 mm的培養(yǎng)皿中能夠培養(yǎng)上千只線蟲(chóng),這對(duì)于藥物的篩選非常重要;其三,秀麗隱桿線蟲(chóng)整個(gè)生命周期都是透明的,可以通過(guò)熒光標(biāo)記來(lái)跟蹤研究線蟲(chóng)體內(nèi)物質(zhì)的變化,比如綠色和紅色熒光蛋白的應(yīng)用,以及活體檢測(cè)跨膜蛋白熱擴(kuò)散(x)。秀麗隱桿線蟲(chóng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于軸突導(dǎo)向、神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)吞作用、脂肪代謝等領(lǐng)域的研究;其四,線蟲(chóng)擁有簡(jiǎn)單但完整的神經(jīng)系統(tǒng),有利于深入研究人類神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能。雖然線蟲(chóng)僅包含302個(gè)神經(jīng)元,2 000個(gè)神經(jīng)肌肉接點(diǎn),大約5 000個(gè)突觸,但它擁有與人類相似的神經(jīng)遞質(zhì),如多巴胺(dopamine,DA)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)和谷氨酸等;其五,許多生物學(xué)工具都可以在線蟲(chóng)中運(yùn)用。線蟲(chóng)的基因組和細(xì)胞譜系能夠被完整的繪制,RNA干擾(RNA interference,RNAi)能夠沉默90%的基因。目前,專門用于線蟲(chóng)的基因芯片探針技術(shù)已經(jīng)被商業(yè)化,并且能從美國(guó)線蟲(chóng)中心獲得各種各樣的基因敲除突變體。此外,相關(guān)遺傳學(xué)操作(正向遺傳學(xué)篩選、反向遺傳學(xué)RNAi篩選和轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng))能夠很容易的完成,特定神經(jīng)元的熒光標(biāo)記能夠在熒光顯微鏡中直接觀察,這就使線蟲(chóng)成為研究神經(jīng)退行性疾病良好的模型。目前,秀麗隱桿線蟲(chóng)已經(jīng)被用于建立多種模型,包括與Aβ相關(guān)的阿爾茨海默病[6]、與α-synuclein相關(guān)的帕金森病[7]、與SOD-1相關(guān)的肌萎縮側(cè)索硬化[8]等。近期,就有研究者利用秀麗隱桿線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因模型,研究藥物的神經(jīng)保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖具有恢復(fù)被百草枯損傷的線粒體的功能,包括膜電位和ATP含量,在多糖的抗氧化活性中主要是壓力響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子DAF-16/FOXO起作用,并通過(guò)調(diào)節(jié)多聚谷氨酰胺和β-淀粉樣蛋白(amyloidβ-protein,Aβ),從而降低 ROS 水平并緩解行為障礙[9]。除此之外,相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)也有了很大進(jìn)步,Cornaglia等[10]利用新的多功能平臺(tái)建立自動(dòng)縱向監(jiān)測(cè)NDs秀麗隱桿線蟲(chóng)模型體內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài),為今后實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化和高通量篩選奠定了基礎(chǔ)。本文主要回顧近幾年來(lái)秀麗隱桿線蟲(chóng)在神經(jīng)退行性疾病研究中的應(yīng)用,從疾病(阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮側(cè)索硬化病)的發(fā)病機(jī)制和潛在治療藥物的篩選兩個(gè)方面來(lái)闡述。

1 秀麗隱桿線蟲(chóng)在阿爾茨海默病(AD)中的應(yīng)用

阿爾茨海默病是癡呆最常見(jiàn)的一種形式,開(kāi)始伴隨著輕微的記憶缺失和混淆,最終導(dǎo)致嚴(yán)重的精神損傷。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究和連鎖分析已經(jīng)確定了695個(gè)基因與阿爾茨海默病(AD)有關(guān),其中絕大多數(shù)與遲發(fā)性AD相關(guān)[11]。目前,病人的醫(yī)療花費(fèi)給家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān),因此,預(yù)防和治療AD已經(jīng)成為人們迫切想要解決的難題之一。

AD神經(jīng)病變逐漸損害思維能力、溝通能力和記憶力。引發(fā)AD的原因有很多,比如遺傳因素、環(huán)境因素、自身因素等。AD患者的大腦皮質(zhì)主要以Aβ沉積的方式形成老年斑。Aβ是由β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)通過(guò)β-分泌酶和γ-分泌酶的逐步裂解而產(chǎn)生的、由40～42個(gè)氨基酸組成的小分子多肽[12]。有研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥可與Aβ產(chǎn)生協(xié)同作用,進(jìn)而加重Aβ對(duì)神經(jīng)元的損傷,并促進(jìn)tau蛋白Thr181位點(diǎn)的過(guò)度磷酸化,是引發(fā)AD的危險(xiǎn)因素[13]。有趣的是,與AD有關(guān)的tau基因突變,并不會(huì)直接導(dǎo)致AD,而是發(fā)生其他NDs,如連鎖于17號(hào)染色體伴帕金森病的額顳葉癡呆(FTDP-17)[14]。

早發(fā)型AD被稱為家族性老年癡呆,是由APP突變或早老素1基因(presenilin-1)和早老素2基因(presenilin-2)的突變致使Aβ增加而導(dǎo)致的。晚發(fā)型AD又被稱為散發(fā)性老年癡呆,可能是由于1個(gè)或多個(gè)基因(APOE,PICALM,CLU/APOJ等)以及環(huán)境的變化而產(chǎn)生的[15]。大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明,Aβ1～42相對(duì)于 Aβ1～40更容易形成低聚物,具有更大毒性[16]。因此,Aβ1～40成為探究AD病情發(fā)展和篩選藥物新的研究方向。秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)存在3種早老素基因,分別為sel-12、hop-1和spe-4,對(duì)LIN-12/Notch信號(hào)傳導(dǎo)有著重要的作用[17]。LIN-12/Notch受體在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用,有研究報(bào)道γ-分泌酶復(fù)合體除了Notch和APP外還有其他的靶點(diǎn)[18]。這就表明,有必要進(jìn)一步探討γ-分泌酶在生物體中的作用。

秀麗隱桿線蟲(chóng)表達(dá)的Aβ42源于人類淀粉樣蛋白前體cDNA,通過(guò)特異性啟動(dòng)子unc-54表達(dá)得到。第一個(gè)秀麗隱桿線蟲(chóng)Aβ模型就是在線蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)人類的Aβ1～42而獲得[19]。目前,已經(jīng)得到多種不同的秀麗隱桿線蟲(chóng)AD轉(zhuǎn)基因模型[20](表1)。秀麗隱桿線蟲(chóng)所表達(dá)的Aβ并不是完整長(zhǎng)度的Aβ1～42,而主要是 Aβ3～42的截?cái)喈a(chǎn)物。體外實(shí)驗(yàn)證明Aβ3～42聚集體和 Aβ1～42相似,但是更容易形成纖維狀結(jié)構(gòu)。同時(shí) Aβ3～42也是產(chǎn)生 Aβ1～40聚集現(xiàn)象的誘發(fā)劑[21]。這個(gè)發(fā)現(xiàn)使線蟲(chóng)成為研究Aβ3～42加工過(guò)程和毒理作用較為理想的模型。此外,相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)在人的細(xì)胞和秀麗隱桿線蟲(chóng)模型中,Aβ能夠提高鐵含量并且容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象[22]。由此可見(jiàn),線蟲(chóng)體內(nèi)Aβ的表達(dá)與鐵含量的積累密切相關(guān)。運(yùn)用Aβ模型研究發(fā)現(xiàn),分子伴侶蛋白HSP-16.2能夠保護(hù)機(jī)體免受Aβ毒性的損傷。與該觀點(diǎn)一致的是轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)經(jīng)過(guò)熱激處理(35℃,2 h)后,會(huì)顯著降低Aβ毒性和Aβ低聚物的含量[23]。這些結(jié)果證明內(nèi)源性分子伴侶蛋白對(duì)Aβ毒性的調(diào)控具有重要作用,同時(shí)也為治療AD提供了新的思路和方法。除此之外,當(dāng)線蟲(chóng)飲食受到限制時(shí),不僅可以提高線蟲(chóng)的壽命,還能夠降低Aβ的毒性[24]。因此,在生物體中機(jī)體的衰老和Aβ之間有著密切的聯(lián)系。

β-淀粉樣蛋白染料—硫代黃素T能夠提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和線蟲(chóng)的壽命,同時(shí)抑制與蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的麻痹癥狀并降低轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)體內(nèi)Aβ的聚集。這些作用主要與HSF-1、SKN-1、分子伴侶、自體吞噬和蛋白酶體的功能密切相關(guān)[25]。這就表明蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可能對(duì)疾病具有奇特的治療效果。在秀麗隱桿線蟲(chóng)Aβ模型中,缺乏OGlcNAc轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)能夠減緩Aβ的毒性,相反,缺乏β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的功能會(huì)加劇Aβ的毒性[26]。由此可見(jiàn),OGT或可成為AD治療潛在的靶點(diǎn)。

表1 秀麗隱桿線蟲(chóng)的AD轉(zhuǎn)基因模型Table1 Transgenic C.elegans models of AD

過(guò)度磷酸化tau蛋白聚集是AD的第二大標(biāo)志,tau蛋白的聚集也代表著一些其他的神經(jīng)退行性疾病,比如皮克氏病、唐氏綜合征和連鎖于17號(hào)染色體伴帕金森病的額顳葉癡呆等。

隨著研究的不斷深入,越來(lái)越多的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)具有抗AD的作用,如中藥提取物、金屬元素、海洋生物等。有研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)四環(huán)素、銅對(duì)Aβ線蟲(chóng)模型均具有很好的保護(hù)作用[27,28],因此,四環(huán)素曾被提議用于治療AD。盡管四環(huán)素和銅對(duì)機(jī)體調(diào)節(jié)的分子機(jī)制并不清楚,但有研究發(fā)現(xiàn)它們主要與Aβ低聚物相互作用,從而防止它們聚集。在秀麗隱桿線蟲(chóng)中,我們觀察到四環(huán)素能防止線蟲(chóng)體內(nèi)Aβ低聚物的聚集并降低其麻痹癥狀。最近,紅芽木提取物被發(fā)現(xiàn)可以降低秀麗隱桿線蟲(chóng)AD模型中Aβ毒性,其主要通過(guò)調(diào)控?zé)嵝菘说鞍譎SP-16.2來(lái)發(fā)揮功能[29]。氧化異阿樸菲生物堿衍生物8-1可以通過(guò)調(diào)節(jié)APP的水平、乙酰膽堿酯酶活力、氧化應(yīng)激和自我吞噬而降低Aβ毒性。這個(gè)研究結(jié)果表明通過(guò)一種化合物多靶點(diǎn)效應(yīng)可以抑制AD相關(guān)的神經(jīng)毒性,在未來(lái)可能成為治療AD的有效方法[30]。中藥復(fù)方六味地黃丸經(jīng)乙醇提取,含有一些酚類如沒(méi)食子酸和丹皮酚,這些成分通過(guò)上調(diào)熱激蛋白和降低活性氧類(reactive oxygen species,ROS)含量,來(lái)減輕Aβ的毒性[31]。除此之外,蔓越橘提取物[32]、水飛薊素[33]、咖啡提取物[34]、白藜蘆醇[35]、生脈方[36]及石榴[37]等物質(zhì)也都可以在線蟲(chóng)模型中通過(guò)降低Aβ的種類減輕Aβ毒性,從而延緩AD的發(fā)病進(jìn)程。

2 秀麗隱桿線蟲(chóng)在帕金森病(PD)中的應(yīng)用

帕金森病是繼AD后與年齡相關(guān)的、在中老年人群中較為常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,自發(fā)或散發(fā)的PD影響近2%的65歲以上的老人[38]。其臨床表現(xiàn)主要為失眠、抑郁、思覺(jué)失調(diào)和認(rèn)知障礙[39]。大腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元缺失導(dǎo)致的多巴胺水平的逐漸減少和身體逐漸失去隨意運(yùn)動(dòng)的能力是帕金森病的兩個(gè)特征。然而,這種神經(jīng)元的缺失不僅僅發(fā)生在多巴胺能神經(jīng)中,膽堿能神經(jīng)、5-羥色胺能神經(jīng)、去甲腎上腺素能神經(jīng)也會(huì)被影響。帕金森病重要的神經(jīng)組織學(xué)特征是其神經(jīng)元中出現(xiàn)路易氏體和營(yíng)養(yǎng)障礙性神經(jīng)突兩種典型的內(nèi)含物。這些內(nèi)含物的出現(xiàn)被當(dāng)成PD臨床癥狀出現(xiàn)前的信號(hào)。除此之外,路易氏體還被當(dāng)成其他的神經(jīng)退行性疾病如路易體癡呆的發(fā)病信號(hào)[40]。突觸核蛋白α-synuclein(α-syn,PARK1 基因編碼)一般以一種低聚物或纖維狀的形式出現(xiàn)在路易氏體和營(yíng)養(yǎng)障礙性神經(jīng)突中[41]。近年有報(bào)道稱,在非變性條件下從神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞系、腦組織及人體細(xì)胞中分離出的α-syn蛋白是以一種約58 kD折疊四聚物的形式出現(xiàn)[42]。這為人們探究α-syn在生物體中的存在狀態(tài)及作用提供了重要的線索。

中國(guó)近90%PD患者為散發(fā)病例,出現(xiàn)在沒(méi)有明確病史的家庭中。盡管這些病例的病因尚不清楚,但大多數(shù)人認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境因素共同造成的。目前為止,近10%的已知病例是由遺傳因素引起的,即眾所周知的家族性帕金森病。他們大腦區(qū)域由于神經(jīng)元退變被高度影響,一些遺傳性的點(diǎn)突變,如A30P、A53T、E46K、H50Q和G51D,以及3對(duì)同作用的SNCA基因,都與常染色體顯性遺傳的家族性帕金森病有關(guān),這些發(fā)現(xiàn)引起更多的人探究自發(fā)性帕金森病病理中α-syn的作用[43]。α-syn和富亮氨酸重復(fù)激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2,又名PARK8)編碼基因的突變對(duì)于常染色體顯性遺傳帕金森病的產(chǎn)生起重要作用。利用秀麗隱桿線蟲(chóng)開(kāi)展的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),LRRK2蛋白的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的缺失;LRRK2的突變會(huì)提高激酶活性從而引起神經(jīng)毒性,在線蟲(chóng)體內(nèi)通過(guò)激酶活性抑制劑GW5074和索拉非尼,可以預(yù)防LRRK2蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病[44]?；谶@些結(jié)果,有人提出采用LRRK2蛋白活性抑制劑來(lái)治療PD。同樣,谷氧還蛋白缺乏也會(huì)加劇秀麗隱桿線蟲(chóng)PD模型的神經(jīng)變性[45]。此外,一些研究發(fā)現(xiàn)家族性PD除了PARK1和LRRK2基因產(chǎn)生突變之外,也會(huì)涉及其他基因的突變,比如PARK2、PARK6和PARK7的突變[46]。PARK2編碼parkin蛋白,parkin具有泛素連接酶E3的活性,能修飾各種蛋白質(zhì);PARK6編碼蛋白激酶PINK1;PARK7編碼DJ-1蛋白,它們主要與常染色體隱性遺傳的PD(如少年型帕金森綜合征)有關(guān)[47]。Hamamichi等[48]通過(guò) RNAi系統(tǒng)的篩選發(fā)現(xiàn),在線蟲(chóng)體內(nèi)可能存在與PD相關(guān)的基因靶點(diǎn)和通路約868個(gè)。在體壁神經(jīng)肌肉中,研究人員通過(guò)異體表達(dá)人類的α-syn并使用綠色熒光特異性標(biāo)記DA神經(jīng)元(Pdat-1::GFP)來(lái)觀察DA神經(jīng)元的變化,同時(shí)發(fā)現(xiàn)如果敲除其中20個(gè)基因能夠顯著增強(qiáng)α-syn的錯(cuò)誤折疊率,在這些基因中,存在之前未經(jīng)報(bào)道但在轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)中對(duì)多巴胺能神經(jīng)元損傷具有明顯保護(hù)作用的基因。這就為PD治療提供了更多的思路。

原則上,秀麗隱桿線蟲(chóng)并不是最好的PD模型,因?yàn)樗狈Ζ?syn編碼基因的同源基因。但線蟲(chóng)遺傳多樣性使人類基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和多巴胺能神經(jīng)元退化研究在線蟲(chóng)中得以實(shí)現(xiàn)。更重要的是,關(guān)于分子遺傳學(xué)的方法在秀麗隱桿線蟲(chóng)中的運(yùn)用不斷成熟,在不同遺傳背景條件下,有關(guān)疾病基因的突變對(duì)神經(jīng)元存活率和功能上的影響都能被仔細(xì)觀察。此外,通過(guò)控制實(shí)驗(yàn)條件也能同時(shí)研究基因和環(huán)境對(duì)疾病的影響。目前,已有20多個(gè)與帕金森病相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn),其中也有部分在秀麗隱桿線蟲(chóng)中存在同源基因(表2),為PD的研究提供了極大的方便。

雌雄同體的秀麗隱桿線蟲(chóng)具有相對(duì)簡(jiǎn)單的多巴胺系統(tǒng),共有8個(gè)神經(jīng)元,分別為頭部6個(gè)多巴胺能神經(jīng)元和尾部2個(gè)多巴胺能神經(jīng)元。雄性線蟲(chóng)較雌雄同體線蟲(chóng)有6個(gè)額外的多巴胺能神經(jīng)元分布在尾部[49]。多巴胺的合成、儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制在線蟲(chóng)體內(nèi)都是遺傳保守的,并且多巴胺神經(jīng)末梢和突觸小泡具有與哺乳動(dòng)物神經(jīng)元相似的作用機(jī)理。大部分秀麗隱桿線蟲(chóng)PD模型主要是將其暴露在神經(jīng)毒素或一些金屬元素中,使其選擇性地?fù)p傷多巴胺能神經(jīng)元而誘導(dǎo)造模。神經(jīng)毒素主要包括6-羥多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)、CuO、錳、l-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)、甲基水銀等。當(dāng)秀麗隱桿線蟲(chóng)暴露在6-OHDA中,表現(xiàn)出一種漸進(jìn)性與選擇性的多巴胺能神經(jīng)元變性和缺失,以神經(jīng)遞質(zhì)小泡在軸突和樹(shù)突的形成作為觀察依據(jù)[50]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)PD模型可以用來(lái)篩選具有神經(jīng)保護(hù)作用的化合物。Lou等[51]發(fā)現(xiàn)柚皮素可以通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路來(lái)預(yù)防6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。對(duì)于抗PD的藥物,中藥具有獨(dú)特的療效,如川芎嗪、遠(yuǎn)志皂苷、人參皂苷等均具有一定的保護(hù)作用[52]。Liu等[53]利用秀麗隱桿線蟲(chóng)PD模型發(fā)現(xiàn),紅藻角叉菜提取物能夠增強(qiáng)線蟲(chóng)對(duì)于氧化應(yīng)激的耐受力,同時(shí)上調(diào)應(yīng)激反應(yīng)基因sod-3和skn-1,從而產(chǎn)生對(duì)生物神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。此外,人們還發(fā)現(xiàn)糙海參提取物也具有抗PD的作用[54]。這些研究都表明,秀麗隱桿線蟲(chóng)模型在研究抗PD藥物中具有極大的優(yōu)勢(shì),方便人們對(duì)于療效好的藥物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。

3 秀麗隱桿線蟲(chóng)在肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)中的應(yīng)用

肌萎縮側(cè)索硬化是一種成人型并具有致命性的大腦和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能紊亂與退化的麻痹癥。大約10%的ALS患者為家族性ALS(familial ALS,FALS),20%的ALS患者與Cu/Zn超氧化物歧化酶基因1(superoxide dismutase1,SOD1)的突變有關(guān)[55]。此外,ubiquilin2[56]、profiling1 等突變不斷在ALS中被發(fā)現(xiàn),ALS相關(guān)基因在秀麗隱桿線蟲(chóng)模型中的應(yīng)用也不斷豐富(表3)。SOD1在生物體內(nèi)較為常見(jiàn),能夠表達(dá)胞質(zhì)蛋白質(zhì),將超氧陰離子轉(zhuǎn)變成過(guò)氧化氫。第一個(gè)SOD1錯(cuò)義突變?cè)?993年被發(fā)現(xiàn),SOD1的突變通常會(huì)使其功能獲得顯著的增強(qiáng),而不是活性的喪失[57]。第一個(gè)ALS模型是在啟動(dòng)子hsp16-2或myo-3的啟動(dòng)下,通過(guò)引入FALS相關(guān)的突變(A4V,G37R和G93A)SOD1而建立的。ALS轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)在一般條件下沒(méi)有明顯的表型,但是在百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下,線蟲(chóng)突變SOD1的表達(dá)就變得非常敏感。并且,氧化應(yīng)激能夠顯著延遲秀麗隱桿線蟲(chóng)突變SOD1蛋白的降解并導(dǎo)致突變SOD1在肌肉細(xì)胞中異常的聚合[58]。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為探究晚發(fā)型FALS提供了新的思路。

表2 PD相關(guān)基因及其在秀麗隱桿線蟲(chóng)中的同源基因Table2 PD-related genes and their homologs in C.elegans

Gidalevitz等[59]以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型,unc-54為啟動(dòng)子,將野生型或突變SOD1蛋白在體壁肌肉細(xì)胞中表達(dá)黃色熒光蛋白作為標(biāo)記來(lái)研究SOD1聚集所帶來(lái)的影響。此外,Silva等[60]進(jìn)行了全基因組RNAi篩選,確定23個(gè)基因能夠抑制G93A SOD1蛋白聚集并恢復(fù)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力,為后期的研究奠定了基礎(chǔ)。

除了unc-54啟動(dòng)子外,秀麗隱桿線蟲(chóng)神經(jīng)元在啟動(dòng)子snb-1的啟動(dòng)下也可以表達(dá)G85R SOD1,表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)缺陷。Lim等[61]利用G85R SOD1轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)aak-2被抑制時(shí),不溶性的SOD1并沒(méi)有降低,卻能夠顯著增強(qiáng)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力。aak-2與老鼠腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)同源,當(dāng)ALS老鼠模型的AMPK被抑制時(shí),同樣能觀察到類似的保護(hù)作用。AMPK是細(xì)胞能量狀態(tài)的主要傳感器,當(dāng)ATP供應(yīng)跟不上需求時(shí)就會(huì)被激活。由此可見(jiàn),AMPK參與ALS有關(guān)的代謝,能量代謝異?？赡芘c運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病相關(guān)。

眾所周知,線蟲(chóng)體內(nèi)daf-2基因編碼胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子受體,胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1信號(hào)通路是機(jī)體衰老關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器,而daf-2的突變能夠顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命[62]。機(jī)體衰老在多種神經(jīng)退行性疾病中是共同的危險(xiǎn)因素,上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明調(diào)節(jié)胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1信號(hào)通路可能會(huì)為ALS的治療帶來(lái)新的突破口。

TDP-43主要分布在細(xì)胞核中,能夠在體內(nèi)廣泛表達(dá),它主要與DNA和RNA結(jié)合,具有多重功能,如轉(zhuǎn)錄抑制、選擇性剪接mRNA以及調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。在ALS患者的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中,TDP-43是泛素陽(yáng)性包涵體的主要組成部分[63]。第一個(gè)與TDP-43有關(guān)的ALS秀麗隱桿線蟲(chóng)模型是以神經(jīng)元經(jīng)snb-1啟動(dòng)子異體表達(dá)人類TDP-43蛋白而獲得[64]。有研究者通過(guò)M337V TDP-43轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)尋找能夠防止TDP-43磷酸化作用的靶點(diǎn),從而探究細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白激酶7(cell division cycle 7-related protein kinase,CDC7)在ALS中作用,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)CDC7的表達(dá)可能是ALS有效的治療方法[65]。

FUS是細(xì)胞核DNA和RNA重要的結(jié)合蛋白,參與了RNA的加工,約5%FALS患者是由于FUS基因的突變而導(dǎo)致的。通過(guò)對(duì)FUS突變影響的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞質(zhì)的錯(cuò)位分布和聚集與漸進(jìn)性運(yùn)動(dòng)功能障礙有關(guān);而且,運(yùn)動(dòng)功能障礙并不能通過(guò)表達(dá)FUS蛋白而被治愈,表明這可能與FUS的突變或其RNA功能紊亂有關(guān)[66]。除此之外,Vaccaro等[67]發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)能夠抑制線蟲(chóng)體內(nèi)TDP-43和FUS的神經(jīng)毒性;Aaron等[68]報(bào)道楓糖漿能夠降低線蟲(chóng)ALS模型中TDP-43蛋白毒性,為今后篩選、治療ALS提供了新的方向。

表3 ALS相關(guān)基因在秀麗隱桿線蟲(chóng)模型中的應(yīng)用Table3 Application of ALS-related genes in C.elegans model

4 小結(jié)與展望

綜上所述,秀麗隱桿線蟲(chóng)可以作為單基因模型來(lái)研究與人類同源的特定基因,還能以人類的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá),從而對(duì)藥物的活性進(jìn)行篩選。由于線蟲(chóng)只有1 mm長(zhǎng),其行為能夠在液體中被清楚的觀察,這就意味著可以用作各種藥物的高通量篩選,有助于尋找新的特定臨床治療藥物。許多人類疾病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)讓我們對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)識(shí)更加深入,一些與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的通路已經(jīng)通過(guò)秀麗隱桿線蟲(chóng)和其他無(wú)脊椎動(dòng)物模型表示出來(lái),這就使得我們可以通過(guò)基因技術(shù)在無(wú)脊椎生物模型中描述眾多守恒的機(jī)制,包括細(xì)胞凋亡、Ras/MAPK、PINK1-Parkin以及其他信號(hào)通路[69]。細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和伴侶蛋白的功能在病理中至關(guān)重要,如特定分子伴侶的過(guò)度表達(dá)能夠改善神經(jīng)毒性[70]。此外,胰島素樣信號(hào)通路在衰老過(guò)程中的作用也能幫助我們探索機(jī)體衰老對(duì)神經(jīng)退行性疾病的影響。

在模式生物中分析與疾病相關(guān)的基因?qū)τ诶斫饧膊〉倪M(jìn)程具有很大幫助。盡管秀麗隱桿線蟲(chóng)并不是研究人類神經(jīng)退行性疾病最好的病理生理學(xué)模型,但由于線蟲(chóng)形體小且透明,利于對(duì)某些疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的神經(jīng)毒性進(jìn)行觀察和分類,且非常適合化合物的光活化,使得新的技術(shù)如光遺傳學(xué)技術(shù)很容易在其中得以應(yīng)用。最重要的是,關(guān)于遺傳學(xué)的研究發(fā)展迅速,例如正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)在線蟲(chóng)模型中的應(yīng)用,已經(jīng)確定了許多與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的新的基因和通路,使我們?cè)谘芯颗c基因相關(guān)的疾病時(shí)能夠廣泛地使用線蟲(chóng)模型。這能幫助我們探究與疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的毒性機(jī)制,從而確定最終導(dǎo)致神經(jīng)元缺失的體內(nèi)因素。盡管人類某些與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的基因已經(jīng)被確定,但對(duì)于神經(jīng)變性的機(jī)理還不能完全解釋清楚。對(duì)于這些基因?qū)е律窠?jīng)元退化的原因及疾病相關(guān)蛋白質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的原因還沒(méi)有明確的定義。隨著這些難題的解決,將會(huì)為NDs的治療提供更好的思路和方法。由此可見(jiàn),隨著科技的不斷發(fā)展,新的技術(shù)和新的致病因子不斷被發(fā)現(xiàn),人們對(duì)于神經(jīng)退行性疾病必然有更加深入的了解和突破,秀麗隱桿線蟲(chóng)在神經(jīng)退行性疾病及其他疾病上的應(yīng)用也會(huì)更加廣泛。

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