C/EBPβ在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的白介素1β成熟過(guò)程中的作用

馬駿，余三九，康華麗，鄧夢(mèng)楊，黃嵐

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由脂質(zhì)代謝紊亂引起的慢性炎癥性疾病，是引起心腦血管疾病的主要病因[1-2]。巨噬細(xì)胞在AS的形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)，分泌大量炎性分子促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡可導(dǎo)致斑塊破裂引發(fā)心腦血管事件[3-5]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)濃度升高是AS發(fā)生的關(guān)鍵性因素[6]。在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)[6-7]。炎癥反應(yīng)是AS發(fā)生發(fā)展的另一重要因素[1]，白介素1β(IL-1β)即為關(guān)鍵性的促炎因子之一。在IL-1β的生成過(guò)程中，前體蛋白(pro-IL-1β)經(jīng)過(guò)剪切形成成熟體蛋白(cleaved-IL-1β)，最后分泌至胞外影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[8]。研究表明，IL-1β單抗治療AS引起的冠心病能明顯降低不良心血管事件發(fā)生率[9]。因此，IL-1β是治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的重要靶點(diǎn)，探索相關(guān)機(jī)制對(duì)于治療AS十分關(guān)鍵。近期有文獻(xiàn)報(bào)道CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)能顯著影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，例如，與普通ApoE-/-小鼠相比，C/EBPβ敲除的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊發(fā)生率明顯降低[10]。C/EBPβ在炎癥調(diào)控方面有著重要作用[11]，有文獻(xiàn)報(bào)道其可增加IL-1β前體蛋白的表達(dá)[12]，然而C/EBPβ是否可以調(diào)控IL-1β前體的成熟并不清楚。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)是調(diào)控IL-1β成熟的關(guān)鍵性蛋白[12]，C/EBPβ是否與caspase-1存在相互作用，值得探究。本研究觀察了C/EBPβ對(duì)IL-1β成熟及分泌的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7從ATCC細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基及Opti-MEM購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胎牛血清及胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，C/EBPβ、IL-1β前體蛋白、IL-1成熟體蛋白、caspase-1及GAPDH單克隆兔抗小鼠抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，ox-LDL購(gòu)自中國(guó)廣州奕源生物公司，ELISA Quantikinekits試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D Systems公司，青霉素、鏈霉素以及Western blotting試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞處理及分組 RAW264.7在含有7%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的RPMI 1640的培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別用0、25、50、100μg/ml ox-LDL處理細(xì)胞12、24、48h，以不同時(shí)間點(diǎn)的0μg/ml ox-LDL為對(duì)照組，利用PCR及Western blotting檢測(cè)C/EBPβ基因及蛋白的表達(dá)變化。觀察到50μg/ml ox-LDL處理24h時(shí)C/EBPβ蛋白表達(dá)開(kāi)始出現(xiàn)明顯上升，選擇該條件作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理?xiàng)l件。采用50μg/ml ox-LDL處理細(xì)胞24h，以0μg/ml ox-LDL為空白對(duì)照組，Western blotting觀察ox-LDL對(duì)caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體蛋白表達(dá)的影響。隨后利用小干擾RNA對(duì)C/EBPβ及caspase-1的表達(dá)進(jìn)行敲減，共分為4組，即未做處理的對(duì)照組，僅用ox-LDL處理的陰性對(duì)照組(對(duì)照+ox-LDL組)，敲減C/EBPβ并用ox-LDL處理的si-C/EBPβ+ox-LDL組，敲減caspase-1并用ox-LDL處理的si-caspase-1+ox-LDL組，觀察C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體蛋白的表達(dá)情況，并采用ELISA法檢測(cè)IL-1β的分泌情況。

1.3 小干擾RNA轉(zhuǎn)染敲減C/EBPβ及caspase-1的表達(dá) C/EBPβ siRNA和caspase-1 siRNA均獲自上海吉瑪公司，序列如下：C/EBPβ，正義鏈5'-CCAUGGAAGUGGCCAACUUTT-3'，反義鏈5'-AAGUUGGCCACUUCCAUGGTT3'；caspase-1 RNA，正義5'-GCUGAAACAUUUGUUGCUATT-3'，反義5'-UAGCAACAAAUGUUUCAGCTT-3'。將RAW264.7細(xì)胞在6孔板(2×106個(gè)細(xì)胞/孔)中培養(yǎng)12h，隨后將siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞再溫育12h，將培養(yǎng)基換成含有7%血清的RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.4 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)C/EBPβ基因的表達(dá)使用RNAiso試劑從處理的RAW264.7細(xì)胞中分離RNA。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)將分離的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR。引物由上海生工合成，以GAPDH mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參照。

1.5 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 將處理完畢的細(xì)胞取出400μl含PMSF(終濃度1mmol/L)的RIPA裂解液(碧云天)，冰上充分勻漿后，4℃、10 000r/min離心15min，并收集上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，之后上樣：每泳道50μg蛋白樣品，SDS-PAGE恒壓電泳(5%濃縮膠階段設(shè)置電壓為80V，時(shí)間60min；10%分離膠階段電壓為120V，時(shí)間1h)直至蛋白分離，然后切膠，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入C/EBPβ鼠單克隆抗體(1:1000)及GAPDH(1:5000)4℃過(guò)夜。次日，TBST洗膜3次(10min/次)。加入二抗(1:10 000，碧云天)，37℃孵育1h；TBST洗膜3次，進(jìn)行曝光。以GAPDH為內(nèi)參照。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β水平 以C/EBPβ蛋白表達(dá)明顯上升時(shí)的條件(50μg/ml ox-LDL處理24h)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，觀察細(xì)胞上清液中IL-1β的水平。RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，采用小干擾RNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，ox-LDL 50μg/ml處理24h后，提取細(xì)胞上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)使用ELISA Quantikine kits檢測(cè)上清液中的IL-1β水平以評(píng)估細(xì)胞IL-1β分泌情況的變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL對(duì)C/EBPβ mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組(1.3700±0.1565)相比，細(xì)胞處理12h后，50μg/ml ox-LDL組C/EBPβ mRNA表達(dá)水平(2.8510±0.2124)明顯升高(P＜0.05)，而100μg/ml ox-LDL組C/EBPβ mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高(P＜0.05)；當(dāng)細(xì)胞處理24h及48h后，25μg/ml ox-LDL組C/EBPβ mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，均呈濃度依賴性增加(圖1)。

2.2 ox-LDL對(duì)C/EBPβ蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞株12h未引起C/EBPβ蛋白水平的明顯變化，而處理24h后，與對(duì)照組(0.2440±0.0219)相比，50μg/ml ox-LDL組C/EBPβ的蛋白表達(dá)(0.3839±0.0106)明顯升高，而100μg/ml ox-LDL組增加更為明顯(P＜0.05)；ox-LDL處理巨噬細(xì)胞株48h后，25μg/ml ox-LDL組C/EBPβ蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，同樣呈濃度依賴性(圖2)。

圖1 不同濃度ox-LDL處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后C/EBPβ mRNA表達(dá)的變化(n=3)Fig.1 C/EBPβ mRNA expression in macrophages treated with different concentrations of ox-LDL for different time (n=3)

圖2 不同濃度ox-LDL處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后C/EBPβ蛋白表達(dá)的變化(n=3，Western blotting)Fig.2 C/EBPβ protein expression in macrophages treated with different concentrations of ox-LDL for different time (n=3, Western blotting)

2.3 ox-LDL對(duì)caspase-1、IL-1β前體及IL-1β成熟體蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，50μg/ml ox-LDL刺激細(xì)胞24h后，caspase-1、IL-1β前體和成熟體蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05，圖3)。

2.4 C/EBPβ或caspase-1敲減后caspase-1、C/EBPβ表達(dá)及IL-1β生成的影響 與對(duì)照組相比，ox-LDL能明顯增加C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前體及成熟體蛋白的表達(dá)以及IL-1β的分泌(P＜0.05，圖4)。敲減C/EBPβ之后，ox-LDL誘導(dǎo)的caspase-1、IL-1β前體及成熟體蛋白表達(dá)以及IL-1β分泌均被明顯抑制，與對(duì)照+ox-LDL組相比分別為0.5302±0.0253 vs.0.8121±0.049、0.6178±0.0500 vs. 0.9788±0.0959、0.2511±0.0298 vs. 0.5485±0.0664及7.626±0.665pg/ml vs. 16.25±1.223pg/ml(P＜0.05，圖4)。而敲減caspase-1之后，僅ox-LDL誘導(dǎo)的IL-1β成熟體表達(dá)及IL-1β分泌被抑制，對(duì)C/EBPβ及IL-1β前體蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響(P＜0.05，圖4)。

圖3 50μg/ml ox-LDL處理細(xì)胞24h后caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體的表達(dá)變化(n=3，Western blotting)Fig.3 Expressions of caspase-1, pro-IL-1β and cleaved-IL-1β in cells treated with 50μg/ml ox-LDL for 24h (n=3, Western blotting)

圖4 C/EBPβ及caspase-1敲減后C/EBPβ、caspase-1、IL-1β前體、IL-1β成熟體的表達(dá)及IL-1β分泌的變化(n=3)Fig.4 Expressions of C/EBPβas well as C/EBPβ, caspase-1, pro-IL-1β and cleaved-IL-1β after caspase-1 knocked down and the IL-1β secretion (n=3)

3 討 論

本研究主要觀察在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-1β的過(guò)程中，C/EBPβ是否可以調(diào)控IL-1β的產(chǎn)生，以及如何進(jìn)行調(diào)控的。結(jié)果顯示，ox-LDL可以濃度依賴性地刺激C/EBPβ表達(dá)上升，同時(shí)，敲減C/EBPβ表達(dá)后，可以引起IL-1β前體、成熟體，以及促進(jìn)IL-1β成熟的關(guān)鍵蛋白caspase-1表達(dá)的降低，最終導(dǎo)致IL-1β分泌減少，而敲減caspase-1并不能引起C/EBPβ表達(dá)的下降。本研究結(jié)果提示，ox-LDL能夠濃度依賴性增加巨噬細(xì)胞內(nèi)C/EBPβ的表達(dá)，與先前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10]。然而，ox-LDL是如何增加C/EBPβ的表達(dá)并不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道Toll樣受體4(TLR4)可以直接調(diào)控C/EBPβ[13]，在ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞后，TLR4表達(dá)升高[14]，因此，我們推測(cè)ox-LDL可能通過(guò)增加TLR4的表達(dá)來(lái)影響C/EBPβ的表達(dá)，但其中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果還顯示ox-LDL可增加IL-1β前體的表達(dá)及成熟，增加促IL-1β成熟的關(guān)鍵性蛋白caspase-1的表達(dá)，并最終增加IL-1β的分泌，這與先前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。在C/EBPβ表達(dá)降低之后，ox-LDL誘導(dǎo)的IL-1β前體、成熟體和caspase-1表達(dá)以及IL-1β分泌均明顯下降，而敲減caspase-1之后，僅IL-1β成熟體的表達(dá)以及IL-1β分泌下降，表明C/EBPβ不僅可以調(diào)控IL-1β前體的表達(dá)，還可調(diào)控caspase-1促IL-1β前體成熟的過(guò)程，并最終通過(guò)這兩方面來(lái)影響IL-1β的分泌。然而，C/EBPβ是如何調(diào)控caspase-1的目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。NLRP3炎性小體是caspase-1關(guān)鍵性的上游分子蛋白，且在脂質(zhì)體刺激下表達(dá)同樣升高[15-16]，因此推測(cè)C/EBPβ調(diào)控caspase-1很可能與NLRP3有關(guān)系，然而進(jìn)一步的機(jī)制有待驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)，ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)C/EBPβ表達(dá)明顯上升，并進(jìn)一步引起促炎因子IL-1β的產(chǎn)生。C/EBPβ促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生的機(jī)制，一是直接增加IL-1β的表達(dá)[12]，二是通過(guò)調(diào)控caspase-1增加IL-1β前體向成熟體的轉(zhuǎn)化。C/EBPβ是調(diào)控IL-1β的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白，有望成為動(dòng)脈粥樣硬化抗炎治療的新靶點(diǎn)。然而，ox-LDL是如何刺激C/EBPβ，以及C/EBPβ是如何調(diào)控caspase-1表達(dá)的，仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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