應用瓊脂糖微球抗體篩選原代乳鼠肺微血管內(nèi)皮細胞新方法的建立

劉姍，劉艷霞，閆承慧，田孝祥，劉丹，劉美麗，張坡，韓雅玲

血管內(nèi)皮細胞覆蓋于血管內(nèi)膜表面，是研究血管生物學的常用模型。血管內(nèi)皮細胞不僅是血液與血管之間的機械屏障，還分泌縮血管因子和舒血管因子與自身細胞受體結(jié)合，在血管通透性、炎癥反應、血管生長等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。微血管內(nèi)皮細胞是研究血管生長、通透性等的重要模型[4-6]。本研究采用瓊脂糖微球抗體篩選法，建立了一種簡便、高效的分離肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)的方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 小于1周齡的清潔級健康C57BL/6乳鼠(購自遼寧長生生物有限公司)，實驗動物許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 主要試劑與儀器 蛋白A/G瓊脂糖微球、Hanks液、膠原酶Ⅰ(美國Thermo Scientific公司)，大鼠抗小鼠CD31抗體(美國BD Pharmingen公司)，BSA牛血清白蛋白、CCK-8(中國Beyotime公司)，異氟烷(中國河北一品制藥股份有限公司)，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、抗生素、生長因子(美國Sciencell公司)，胰蛋白酶(中國上海生工公司)，明膠(美國Sigma公司)，基質(zhì)膠(美國Corning公司)，山羊抗CD31抗體、兔抗血管性血友病因子(vWF)抗體、Cy3山羊抗兔熒光二抗、Cy3驢抗山羊熒光二抗、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(中國谷歌生物公司)，常溫離心機(英國Grant-Bio公司)，低溫離心機、酶標儀(德國Eppendorf公司)，旋轉(zhuǎn)混合儀(中國寧波新芝公司)，倒置相差顯微鏡、共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)。

1.3 乳鼠PMVECs的分離與培養(yǎng)

1.3.1 制備CD31抗體瓊脂糖微球 在超凈臺內(nèi)，取無菌EP管，將20μl瓊脂糖微球加入400μl 0.1%BSA溶液中，將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)1min；靜止5min后吸除上清，用0.1% BSA重懸，置于旋轉(zhuǎn)混合儀旋轉(zhuǎn)。該操作重復3次，盡量去除瓊脂糖微球溶液中對細胞有害的疊氮化鈉。上述EP管中加入10μl的CD31抗體，制備成CD31抗體瓊脂糖微球，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)混合，于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。

1.3.2 原代PMVECs的培養(yǎng) 將乳鼠用異氟烷麻醉后，以75%乙醇浸泡處死。在超凈臺內(nèi)解剖乳鼠，用無菌生理鹽水沖洗肺臟，盡量去除血細胞，取肺臟邊緣組織置于含有Hanks液的100mm培養(yǎng)皿中。然后用無菌剪刀盡量將肺臟剪碎約1min。先將25ml的0.2%膠原酶置入50ml離心管中，在37℃水浴箱中預熱。再將剪好的肺臟放入預熱的膠原酶中，在37℃、200r/min的搖床內(nèi)孵育45min。用無菌的玻璃研磨器研磨肺組織懸液，小心避免起泡沫。將研磨后的肺組織放入無菌的15ml離心管中，4℃、1300r/min離心8min，吸盡上清及未研碎的組織，剩下細胞沉淀。用1ml的0.1%冰BSA溶液重懸細胞，4℃、1300r/min離心8min，吸盡上清，剩下的沉淀為肺內(nèi)混合細胞(本步驟重復3次)。用1ml的PBS溶液重懸細胞，吸至新的1.5ml無菌EP管中，再加入50μl CD31抗體瓊脂糖微球，將EP管置于旋轉(zhuǎn)混合儀中，室溫旋轉(zhuǎn)混合10min，使PMVECs特異性地與CD31抗體瓊脂糖微球結(jié)合。1000r/min離心2min后，混合液分3層，吸盡上清及下層未與微球結(jié)合的細胞，留取中層微球至新的EP管中。用1ml的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基重懸微球細胞，盡量使細胞與微球分離，將混合液加入含1ml內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基的6孔板(0.1%明膠包被)中。PMVECs的分離示意圖見圖1。

圖1 PMVECs分離示意圖Fig.1 Sketch of isolating PMVECs

1.3.3 傳代培養(yǎng) 細胞貼壁后，用PBS洗3次，更換新鮮的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，去除殘留的微球。當內(nèi)皮細胞融合達到80%時，吸盡培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入0.25%胰酶消化3min，加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基及時終止消化。1000r/min離心5min，用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2比例傳代至6孔板內(nèi)。

1.4 形態(tài)學觀察 用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)和形態(tài)學變化。將倒置顯微鏡調(diào)至100倍放大倍數(shù)，觀察單個細胞形態(tài)及整體細胞生長情況并拍照。

1.5 細胞鑒定

1.5.1 免疫熒光染色 用免疫熒光染色法分別檢測CD31、vWF的表達。用第2代細胞制備細胞爬片。4%多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，0.2% Triton X-100穿膜通透15min，PBS洗3次，5%山羊血清封閉，室溫孵育30min。加入CD31抗體(1:100)100μl，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS洗3次，加入Cy3驢抗山羊熒光二抗(1:100)100μl，室溫避光孵育1h。PBS洗3次。DAPI(1:1000)100μl染細胞核30s。最后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。vWF免疫熒光染色方法同上，采用Cy3山羊抗兔熒光二抗。兩種抗體免疫熒光染色各隨機選取5個視野，重復3次，分別計算PMVECs陽性率。PMVECs陽性率=(陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%

1.5.2 PMVECs體外血管形成實驗 實驗前1d將基質(zhì)膠放在冰上，置于4℃冰箱過夜融化。用預冷的槍頭取出基質(zhì)膠，在24孔板上每孔加入289μl基質(zhì)膠。將24孔板置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，使基質(zhì)膠凝固。輕輕滴加PMVECs細胞懸液300μl(105個細胞)。采用倒置顯微鏡每隔2h觀察1次PMVECs的體外血管形成情況。

1.6 CCK8法繪制PMVECs生長曲線 取第2代PMVECs以每孔5000個細胞接種在96孔板上。實驗分為對照組和PMVECs組，每組設3個復孔。在細胞貼壁后，吸出原培養(yǎng)基，加入10μl CCK-8溶液和新鮮內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基90μl，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，檢測450nm波長處的吸光度(OD)值。同法連續(xù)測7d。繪制PMVECs的生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 PMVECs的形態(tài)學觀察結(jié)果 PMVECs貼壁24h后，倒置顯微鏡下可見細胞呈短梭形、類圓形貼壁生長(圖2A)；PMVECs貼壁72h后，可見細胞單層融合呈典型鋪路石樣排列(圖2B)。

2.2 細胞鑒定

2.2.1 細胞免疫熒光染色 山羊抗CD31抗體免疫熒光染色后，胞質(zhì)呈紅色熒光，DAPI染細胞核呈藍色熒光(圖3A)。兔抗vWF抗體免疫熒光染色后，胞質(zhì)呈紅色熒光，DAPI染細胞核呈藍色熒光(圖3B)。兩種內(nèi)皮細胞特異性抗體CD31、vWF均表達陽性，證實培養(yǎng)的細胞為PMVECs。通過隨機選取5個視野，重復3次，CD31染色PMVECs陽性率為91.35%±3.06%，vWF染色PMVECs陽性率為92.99%±2.67%。

2.2.2 PMVECs體外血管形成實驗 PMVECs接種至基質(zhì)膠，每隔2h觀察1次，發(fā)現(xiàn)在接種8h后，已完整形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖2 倒置顯微鏡下觀察的細胞形態(tài)學結(jié)果(×100)Fig.2 Morphology of PMVECs (Inverted microscope ×100)

圖3 免疫熒光染色結(jié)果(×100)Fig.3 Immunofluorescence staining of PMVECs (×100)

圖4 PMVECs接種8h后基質(zhì)膠上形成的血管管狀結(jié)構(gòu)(×40)Fig.4 Vascular tubular structure formed on matrigel 8h after inoculation of PMVECs (×40)

2.3 CCK8法繪制生長曲線 PMVECs接種后前2d，細胞貼壁生長，細胞增殖較為緩慢。接種后2～5d，細胞處于對數(shù)期生長。接種后7d，細胞增殖減慢，甚至出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象(圖5)。

圖5 CCK8法繪制的生長曲線Fig.5 Growth curve drawn by CCK8 method

3 討 論

獲取微血管內(nèi)皮細胞的常用方法有組織塊貼壁法[7]、酶消化法[8]、免疫磁珠法[9]。通過組織塊貼壁法獲得的PMVECs培養(yǎng)時間長，首次傳代時間為13.0±0.7d。通過酶消化法獲得的PMVECs陽性率(61.05%±7.38%)不高[10]。通過免疫磁珠法獲得的PMVECs雖然細胞純度較高，但操作需有特殊儀器，且試劑比較昂貴。本研究采用的CD31抗體瓊脂糖微球法是通過抗原抗體結(jié)合的方式篩選出PMVECs，具有培養(yǎng)時間短、陽性率高、操作簡便等優(yōu)勢，首次傳代時間少于4d，PMVECs陽性率超過90%。

蛋白A/G瓊脂糖微球是將蛋白A/G共價耦聯(lián)在固體載體瓊脂糖微球上，常用于免疫沉淀或免疫共沉淀實驗，對蛋白功能進行研究。CD31被稱為血小板內(nèi)皮細胞黏附分子，主要表達于內(nèi)皮細胞、血小板、巨噬細胞，被認為是一種不成熟和成熟的血管內(nèi)皮細胞標記物[11]。CD31的同種型是IgG2a，與蛋白A/G的結(jié)合屬于強結(jié)合[12]。蛋白A/G瓊脂糖微球和CD31抗體預先孵育，使微球能夠特異性吸附抗原，而PMVECs細胞表面存在與CD31抗體結(jié)合的特異性抗原，這樣就可以通過瓊脂糖微球?qū)MVECs吸附分離出來。本方法重復多次，均可成功分離、培養(yǎng)出PMVECs。

在本實驗的PMVECs培養(yǎng)過程中需要注意以下5個方面：①選用1周內(nèi)的乳鼠，其細胞增殖能力強，可縮短細胞培養(yǎng)周期。細胞在3代以內(nèi)生長快且形態(tài)穩(wěn)定，可用于實驗研究。②采用0.1%明膠包被6孔板，有利于細胞的貼壁生長。分離培養(yǎng)過程中，有時混雜少量成纖維細胞，采用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基、內(nèi)皮細胞生長因子，可抑制成纖維細胞的生長。另外，采用差速消化法，傳代過程中胰酶消化3min及時終止消化，此時大多數(shù)內(nèi)皮細胞被消化下來，而成纖維細胞仍舊貼壁。③選用膠原酶Ⅰ，能溫和地將研磨后的肺組織消化成單個細胞，優(yōu)于其他消化酶。④CD31表達于內(nèi)皮細胞表面，其免疫熒光染色陽性是內(nèi)皮細胞的經(jīng)典鑒定方式。vWF僅在內(nèi)皮細胞、血小板、巨核細胞和合體滋養(yǎng)細胞中表達，在內(nèi)皮細胞中存儲于桿狀Weibel-Palade小體中，可產(chǎn)生核周染色[13]。⑤基質(zhì)膠是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤(富含細胞外基質(zhì)蛋白)中提取的，其主要成分是層粘連蛋白，其次是Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等。實驗證明內(nèi)皮細胞借助基質(zhì)膠可形成血管管狀結(jié)構(gòu)[14]。

綜上，本實驗室采用瓊脂糖微球抗體篩選法分離、培養(yǎng)乳鼠原代PMVECs，方法簡便、高效，是一種值得推廣的分離培養(yǎng)乳鼠PMVECs的新方法，為血管功能研究等提供了參考。

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