特異性Aurora激酶抑制劑對(duì)人乳腺癌原代細(xì)胞增殖、周期、自噬、凋亡的影響及其機(jī)制

張?jiān)?，孫光源，姜偉華，孫健，范敬靜，宋文麗，信國(guó)峰，張志生

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

近年乳腺癌發(fā)病率越來(lái)越高，已居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，且發(fā)病年齡趨于年輕化。手術(shù)治療后的輔助化療是目前乳腺癌的主要治療手段，但不良反應(yīng)較大，嚴(yán)重影響患者身體健康。靶向治療是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，曲妥珠單抗是常用的乳腺癌靶向治療藥，但是只針對(duì)Her-2陽(yáng)性的患者，治療靶點(diǎn)單一，對(duì)Her-2陰性的患者無(wú)治療作用。Aurora激酶家族是由AuroraA、AuroraB、AuroraC組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，Aurora 激酶A、B在肺癌、白血病、甲狀腺癌等腫瘤中均呈過(guò)表達(dá)，且與染色體的不穩(wěn)定性、致癌的轉(zhuǎn)變、腫瘤增殖和化學(xué)抗性都有關(guān)，是目前抗腫瘤藥物中最具發(fā)展前途的作用靶點(diǎn)[1～3]。AT9283是一種新型的小分子Aurora激酶抑制劑，可特異性抑制AuroraA、AuroraB。文獻(xiàn)[3]報(bào)道AT9283可誘導(dǎo)肺癌、甲狀腺癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。目前關(guān)于其在乳腺癌原代細(xì)胞中的作用相關(guān)研究報(bào)道較少。2015年5月～2016年8月，我們觀察了AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞增殖、周期、自噬、凋亡的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人乳腺癌瘤組織來(lái)自河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，采用細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)原代細(xì)胞。在無(wú)菌條件下收集乳腺癌原發(fā)病灶標(biāo)本，去除壞死組織，用含有青霉素和鏈霉素的PBS漂洗2～3次，將組織剪碎，1 000 r/min離心5～10 min，棄上清液，加入含200 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，定期換液,傳代培養(yǎng)。AT9283購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司； p-Aurora A、磷酸化的組蛋白H3(p-Histone H3)、Aurora A、Histone H3、p21、p53、Bcl-2、Bax一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購(gòu)于BD公司(美國(guó))；DAPI染液、熒光標(biāo)記二抗、小鼠超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；β-tubulin一抗及二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；吖啶橙染料購(gòu)于Sigma公司；FACScan流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞細(xì)胞核和紡錘體的影響觀察 取適對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌原代細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至103/mL，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜使其貼壁。加入1 μmol/L的AT9283，培養(yǎng)48 h，棄上清，預(yù)冷的PBS洗三次(5 min/次)，4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、1%BSA封閉后，孵一抗β-tubulin(1∶200)4 ℃濕盒過(guò)夜，孵二抗鼠抗1∶200室溫2 h ，DAPI著色5～10 min，1×PBS洗三次后封片，熒光顯微鏡下觀察，共聚焦顯微鏡下采圖， 觀察AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞細(xì)胞核和紡錘體的影響。

1.3 AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響觀察取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞，1×104/mL細(xì)胞濃度接種于 96 孔板，每孔 0.1 mL,將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(1、2、3、4、5組)和對(duì)照組，1、2、3、4、5組分別加入2 mL的 0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/LAT9283，對(duì)照組不做任何處理。①分別于培養(yǎng)24 、48 h時(shí)取各組細(xì)胞 ,每孔加入20 μL 5 g /L的 MTT，培養(yǎng) 4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜 200 μL，震蕩 10 min充分溶解顯色，酶標(biāo)儀波長(zhǎng) 570 nm處檢測(cè)各孔光密度值(OD值) ，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%。②培養(yǎng)24 h時(shí)取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，冷PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心，5 min兩次，預(yù)冷的95%乙醇固定，離心乙醇固定的細(xì)胞，棄去乙醇，加入PI(50 μg/mL)與RNase(1 μg/mL)混合物500 μL作用15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)分析，檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞，并用multicycle軟件分析各組細(xì)胞周期。③培養(yǎng)24 h時(shí)取各組細(xì)胞，提取蛋白樣品30 μg，分別行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，37 mA恒流1 h將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛奶TBST封閉纖維素膜0.5 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌 3次，然后與二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)室溫孵育1 h后TBST洗滌3次， ECL顯影，曝光?？笰urora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、p21、p53、Bcl-2、Bax，抗體稀釋比例為1∶1 000，β- actin抗體稀釋比例為1∶10 000，二抗稀釋比例1∶10 000。用圖像分析系統(tǒng)分析，以積分光密度值表示相應(yīng)目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞自噬、凋亡的影響觀察 將乳腺癌原代細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后分為A、B、C、D四組，A、B、C組分別加入0.1、1、10 μmol/L的AT9283，D組不做任何處理，共培養(yǎng)24 h。①取各組細(xì)胞，加入吖啶橙(1 mg/L)避光染色30 min。采用流式細(xì)胞儀測(cè)算細(xì)胞自噬率(橙紅色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞占總細(xì)胞比例)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②取各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1 × 106/mL，冷PBS洗滌兩次。加入Binding 緩沖液100 μL、FITC Annexin-Ⅴ 5 μL、PI(50 μg/mL)10 μL，室溫避光孵育15 min后加入Binding 緩沖液400 μL細(xì)胞懸液中加入孵育20～30 min 。采用流式細(xì)胞儀FACScan測(cè)定，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果

2.1 AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞細(xì)胞核和紡錘體的影響 未處理乳腺癌原代細(xì)胞的細(xì)胞核和紡錘體沒(méi)有改變，AT9283處理的乳腺癌原代細(xì)胞鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核形態(tài)改變，出現(xiàn)核分葉現(xiàn)象，產(chǎn)生多核細(xì)胞，紡錘體由雙極變?yōu)閱螛O, 出現(xiàn)紡錘體紊亂。

2.2 AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響

2.2.1 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率比較 1、2、3、4、5組細(xì)胞增殖抑制率均升高，且呈濃度依賴性(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)24、48 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率

2.2.2 各組細(xì)胞周期比較 與對(duì)照組比較，各組G2/M期細(xì)胞所占比例降低，G0/G1、S期細(xì)胞比例升高(P均<0.05)，且呈濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞周期分布情況

2.2.3 各組細(xì)胞AuroraA、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、p21、p53、Bcl-2、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見(jiàn)表3、4。

表3 各組細(xì)胞AuroraA、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表4 各組細(xì)胞p21、p53、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞自噬、凋亡的影響

2.3.1 各組細(xì)胞自噬率比較 A、B、C、D組自噬率分別為1.03%±0.01%、5.02%±0.31%、10.11%±0.31%、14.52%±0.21%，組間兩兩比較，P<0.05。見(jiàn)圖1。

注：箭頭所指為發(fā)生自噬的細(xì)胞

圖1各組細(xì)胞自噬情況

2.3.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較 培養(yǎng)24 h時(shí)A、B、C、D組凋亡率分別為3.03%±0.14%、8.25%±0.31%、12.15%±0.31%、44.52%±1.34%，組間兩兩比較，P<0.05。

3 討論

Aurora激酶家族成員包括AuroraA、Aurora B、AuroraC[4～6],它們的功能主要是參與調(diào)節(jié)中心體、微管功能，保證染色體精確分離和有效的胞質(zhì)分離[7]，通常都在G2/M期表達(dá)達(dá)到高峰，調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換，是推動(dòng)M期進(jìn)展的關(guān)鍵因子[8～10]。Aurora激酶與乳腺癌的關(guān)系密切，AuroraA基因最初從乳腺癌中分離出來(lái)，AuroraA可誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生，乳腺癌中AuroraA和AuroraB的表達(dá)比較常見(jiàn)，表達(dá)率為26%～94%[11～13]。本研究前期研究發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織AuroraA呈低表達(dá)，而浸潤(rùn)性乳腺癌組織AuroraA呈高表達(dá)，二者比較， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AuroraA高表達(dá)是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，并且與預(yù)后相關(guān)[14]。AuroraA主要負(fù)責(zé)中心體的繁殖和分離，雙極紡錘體的聚集，有絲分裂的進(jìn)入與退出，對(duì)中心體的成熟和紡錘體的裝備起著重要的作用。AuroraB在有絲分裂中期參與調(diào)節(jié)染色體的雙定位及其分離。AuroraA、B轉(zhuǎn)化為磷酸化的AuroraA、B才能發(fā)揮活性[15]。

AuroraA和AuroraB在C末端催化區(qū)域有71%的相似性，其高度保守性對(duì)底物和抑制劑的特異性很重要, 可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ATP抑制Aurora激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化，從而阻斷下游信號(hào)的傳遞，此通路的抑制會(huì)激活乳腺癌原代細(xì)胞的自噬[16]。Aurora A轉(zhuǎn)化為磷酸化Aurora A才能發(fā)揮活性,p53的表達(dá)需要激活DNA周期檢查點(diǎn)基因和凋亡基因，磷酸化Aurora A 為p53的上游效應(yīng)分子，p21為p53的下游效應(yīng)分子，G2/M期細(xì)胞周期進(jìn)展受p53的調(diào)控，因而干擾磷酸化的Aurora A形成會(huì)影響到G2/M細(xì)胞周期的運(yùn)行及p53的表達(dá)[17]。自噬是一種溶酶體依賴性降解途徑，涉及細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白和受損傷細(xì)胞器的降解，其既是細(xì)胞保守的自我防御機(jī)制，又是一種程序性細(xì)胞死亡機(jī)制，與機(jī)體的多種疾病有密切關(guān)系，自噬具有獨(dú)特的形態(tài)改變和特有的調(diào)控通路[18]，Aurora激酶通路的抑制，從而激活乳腺癌原代細(xì)胞的自噬發(fā)生，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

近幾年AuroraA和AuroraB作為抗腫瘤的靶點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，但是在乳腺癌細(xì)胞中研究并不多。AT9283是小分子多靶點(diǎn)Aurora激酶抑制劑，同時(shí)抑制AuroraA和AuroraB, Aurora激酶通過(guò)與其底物(p53、BRCA-1等)結(jié)合，發(fā)生自身磷酸化從而被激活，其與Aurora激酶抑制劑的平衡關(guān)系對(duì)正常有絲分裂至關(guān)重要[19]，抑制AuroraA可引起G2/M期阻滯，磷酸化組蛋白H3的減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，抑制AuroraB引起細(xì)胞核分裂失敗，多核細(xì)胞形成，從而形成多倍體細(xì)胞，細(xì)胞發(fā)生凋亡[20]，此通路受抑制后，細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，加速細(xì)胞的凋亡，本研究以人乳腺癌原代細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)AT9283對(duì)乳腺癌原代細(xì)胞的增殖抑制以及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響，對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。乳腺癌原代細(xì)胞未貼壁時(shí)可見(jiàn)大量的成簇腫瘤細(xì)胞、單個(gè)腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞碎片，培養(yǎng)3～5 d后只見(jiàn)少量的腫瘤細(xì)胞貼壁，12～14 d可見(jiàn)大量腫瘤細(xì)胞貼壁，在正常乳腺癌組織中AuroraA低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，在乳腺癌組織中高表達(dá)，可作為乳腺癌的特有標(biāo)志，為乳腺癌診療提供依據(jù)，本研究中MTT顯示10 μmol/L AT9283 作用于乳腺癌原代細(xì)胞24、48 h抑制率均較高，流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞周期在加藥組出現(xiàn)了明顯的G2/M期阻滯，G0/G1期、S期細(xì)胞比例降低，G2/M期細(xì)胞比例升高，且在1 μmol/LAT9283作用于乳腺癌原代細(xì)胞48 h可見(jiàn)多倍體形成，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中Western blotting結(jié)果顯示磷酸化AuroraA和磷酸化組蛋白H3的表達(dá)隨著濃度的增加逐漸減少。隨著AT9283藥物濃度的增加伴隨p53的蛋白表達(dá)量增加，這說(shuō)明細(xì)胞的增殖抑制可能與上調(diào)p53的表達(dá)，不能有效調(diào)節(jié)G2/M期細(xì)胞周期的進(jìn)展有關(guān)。乳腺癌原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度AT9283處理后Bcl-2與Bax的表達(dá)呈相反趨勢(shì)，即促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量減少，細(xì)胞進(jìn)入凋亡。

綜上所述，AT9283可抑制乳腺癌原代細(xì)胞的增殖，使G2/M期細(xì)胞所占比例降低，G0/G1、S期細(xì)胞比例升高，促進(jìn)細(xì)胞自噬、凋亡，且作用呈劑量依賴性。其機(jī)制可能為AT9283抑制乳腺癌原代細(xì)胞p-AuroraA、p-Histone H3、Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)p21、p53、Bax表達(dá)。

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