消癥益肝片中抗肝癌活性成分的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

賴 昕，林珠燦，余麗雙，黃雪雪，陳 莉

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建，福州 350122）

原發(fā)性肝癌(primary carcinoma of the liver, PLC,以下簡稱肝癌) 是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。PLC在我國高發(fā)，目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的55%[1]。以美洲大蠊提取物為原料的消癥益肝片，臨床上用于治療原發(fā)性肝癌療效顯著，使用后可使病人肝大回縮顯著，肝區(qū)痛感減輕、食欲增加、乏力好轉(zhuǎn)、腹脹減輕，甲胎蛋白下降，帶瘤患者生存期延長[2]，但該藥的抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊中的化學(xué)成分主要有氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、脂肪酸、信息素、殼聚糖等[3]。

國內(nèi)外對美洲大蠊抗腫瘤活性成分的研究多為粗分離產(chǎn)物或肽類物質(zhì)的作用[4-6]，對小分子活性物質(zhì)研究較少。本課題采用 MTT法追蹤抗腫瘤活性，并利用Sephadex LH20和反相高效液相色譜對消癥益肝片中的小分子活性物質(zhì)進(jìn)行研究，旨在為該藥的進(jìn)一步應(yīng)用及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用消癥益肝片浸膏干燥粉末由福州海王金象中藥制藥有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Invitrogen公司）；胎牛血清（PAN-Biotech公司）；Penicillin-Streptomycin雙抗；胰酶（GIBCO公司）； MTT（Sigma公司）；DMSO（AR,國藥集團(tuán)）。

Sephadex LH20葡聚糖凝膠（GE公司）；反相液相色譜柱Chromatorex C18柱（250 mm × 20 mm，10 μm），TPQ05-2546WT（250 mm ×4.6 mm）（北京慧德易科技有限責(zé)任公司）；Bruker AVANCE III 500氫核磁共振（Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取和純化

30 g消癥益肝片浸膏經(jīng)70 %乙醇超聲浸提2次，離心過濾的上清經(jīng)濃縮后，以0.22 μm濾膜過濾，上樣于Sephadex LH20葡聚糖凝膠柱。用70 %甲醇以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，并記錄280 nm下的色譜曲線。根據(jù)記錄的色譜曲線合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干溶劑，得到1-1、1-2、1-3、1-4四個粗提物組分。

經(jīng)MTT法檢測，組分1-3和1-4體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性較強(qiáng)，對這兩個組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。將粗提物組分溶于70 %甲醇，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣于Chromatorex C18反相液相色譜柱。組分1-3以甲醇-0.2%甲酸水（55：45）恒比例洗脫，柱溫30 ℃，檢測波長228 nm，流速為10 mL/min，收集保留時間為12.5 min的餾分。組分1-4以甲醇-0.2%甲酸水（55：45）洗脫，檢測波長254 nm，流速為10 mL/min，分別收集保留時間為18.8 min和42min的餾分。餾分濃縮后以250 mm×4.6 mm的反相液相色譜柱檢測純度為 97.94%、98.45%和96.64%，分別為化合物I（5 mg）、II（1 mg）和 III（3 mg）。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與體外增殖抑制實(shí)驗(yàn)[7]

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為，消化、收集處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，按每孔4×103個細(xì)胞/100 μL接種到96孔板中。各實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的化合物（以DMEM稀釋），每種濃度設(shè)5個平行孔。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，小心吸去上清，每孔加入 100 μL DMSO充分溶解，于酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光值。

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值）/對照組吸光值×100%。

用SPSS 16.0軟件計算相應(yīng)物質(zhì)的半數(shù)抑制濃度（）。

2 結(jié)果

2.1 體外抗肝癌活性檢測

采用 MTT法測定化合物 I～I(xiàn)II對肝癌細(xì)胞HepG2生長的抑制作用，作出劑量-反應(yīng)曲線（圖1～3），用SPSS16.0計算化合物對HepG2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。三個化合物均有體外抑制HepG2細(xì)胞增殖的活性，其中化合物II和III作用較強(qiáng)，并呈時間-劑量依賴關(guān)系；而化合物I的作用較弱，實(shí)驗(yàn)中不表現(xiàn)劑量依賴?；衔?II作用于HepG2細(xì)胞48、72 h的IC50分別為87.7、61.5 μg/mL，化合物III作用于HepG2細(xì)胞48、72 h的IC50分別為 48.6、17.3 μg/mL。

圖1 化合物I對HepG2細(xì)胞增殖的抑制活性Fig.1 The anti-proliferation effects of compound I on HepG2

圖2 化合物II對HepG2細(xì)胞增殖的抑制活性Fig.2 The anti-proliferation effects of compound II on HepG2

圖3 化合物III對HepG2細(xì)胞增殖的抑制活性Fig.3 The anti-proliferation effects of compound III on HepG2

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ無色針狀結(jié)晶（甲醇）; UV (MeOH)nm：228;ESI-MS m/z: 1(500 MHz,δ: 7.95 (2H, d,J= 10.0 Hz, H-2,6),7.50 (2H, t,J= 10.0 Hz, H-3,5), 7.62 (1H, t,J= 10.0 Hz, H-4)。以上理化性質(zhì)與光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]苯甲酸數(shù)據(jù)對照相符，故鑒定化合物Ⅰ為苯甲酸。

化合物Ⅱ無色針狀結(jié)晶（甲醇）; UV (MeOH)nm：257; ESI-MS m/z: 165(500 MHz, DMSO) δ: 7.81 (2H, d,J= 10.0 Hz,H-2,6), 6.84 (2H, d,J= 10.0 Hz, H-3,5), 4.25 (2H, q,J= 10.0 Hz,), 1.29 (3H, t,J= 10.0 Hz,)。以上理化性質(zhì)與光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]對羥基苯甲酸乙酯數(shù)據(jù)對照相符，故鑒定化合物Ⅱ?yàn)閷αu基苯甲酸乙酯。

化合物Ⅲ無色針狀結(jié)晶（甲醇）; UV (MeOH)nm：257; ESI-MS m/z: 179(500 MHz, DMSOδ: 7.81 (2H, d,J= 10.0 Hz,H-2,6), 6.85 (2H, d,J= 10.0 Hz, H-3,5), 4.16 (2H, t,J= 5.0 Hz,), 1.70 (2H, q,J= 5.0 Hz,), 0.95(3H, t,J= 5.0 Hz,。以上理化性質(zhì)與光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]對羥基苯甲酸丙酯數(shù)據(jù)對照相符，故鑒定化合物Ⅲ為對羥基苯甲酸丙酯。

圖4 化合物I～I(xiàn)II的結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Chemical structure of compound I～I(xiàn)II

3 小結(jié)

近年來，中醫(yī)藥制劑在控制肝癌病情發(fā)展、防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期和減輕痛苦等方面的應(yīng)用中越來越受到重視。消癥益肝片是以美洲大蠊提取物為主要成分的中藥制劑，有破瘀化積、消腫止痛的功效，臨床治療原發(fā)性肝癌有一定療效。研究顯示，美洲大蠊的提取物在體外可有效抑制肝癌細(xì)胞生長[11]，還可降低人肝癌細(xì)胞 Bel-7402 線粒體膜電位，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中Bax的表達(dá)，同時抑制Bcl-2的表達(dá)，通過線粒體途徑誘導(dǎo) Bel-7402和SMMC-7721細(xì)胞凋亡[12-13]。此外，有研究顯示，美洲大蠊提取物有抑制人肝癌細(xì)胞 Bel-7402裸鼠移植瘤生長、下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子 ( VEGF) 的作用[14]，并提高H22肝癌小鼠的胸腺指數(shù)、肝臟指數(shù)及脾臟指數(shù)[15]。這些研究多針對美洲大蠊的粗分離產(chǎn)物或活性肽類物質(zhì)，對其中的小分子活性物質(zhì)研究較少。

本課題利用MTT法，以抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖活性為指標(biāo)，通過Sephadex LH20、RP-HPLC等色譜方法，分離得到了3個活性小分子化合物；采用 MS、等光譜學(xué)方法分析，其結(jié)構(gòu)分別為苯甲酸（I）、對羥基苯甲酸乙酯（II）、對羥基苯甲酸丙酯（III），均為首次從消癥益肝片中分離得到。本研究結(jié)果表明，三個化合物均有體外抑制HepG2細(xì)胞增殖的活性，其中對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸丙酯對HepG2腫瘤細(xì)胞作用較強(qiáng)，呈時間-劑量依賴關(guān)系，作用于 HepG2細(xì)胞 48 h的IC50分別為87.7、48.6 μg/mL；作用72 h的IC50分別為61.5、17.3 μg/mL。有研究表明，對羥基苯甲酸乙酯可通過生成鄰醌，耗竭胞內(nèi)GSH，生成活性氧(ROS)和產(chǎn)生線粒體毒性，在黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-28中發(fā)揮細(xì)胞毒作用[16]。但化合物 I～I(xiàn)II在HepG2細(xì)胞中的作用尚未見報道。本課題后續(xù)將對幾個化合物在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制作進(jìn)一步的研究。

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