天麻醇提物對灰樹花胞外多糖單糖組成和生物活性的影響

蘆紅云， 吳天祥,2,*， 湯慶莉， 鐘 敏， 聶文強

(1.貴州大學 釀酒與食品工程學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 明德學院， 貴州 貴陽 550025)

目前，絕大多數(shù)具有多種生物活性的多糖都來源于真菌，尤其是食用真菌，如香菇、灰樹花、革蓋菌屬、裂褶菌屬等[1]。韓建濤[2]對灰樹花胞外多糖單糖組成進行分析，發(fā)現(xiàn)其單糖組分為甘露糖、葡萄糖和木糖，物質(zhì)的量比為16.87∶1∶2.99。體內(nèi)實驗研究表明，灰樹花多糖對提高免疫力和抑瘤效果顯著[3]。Konno[4]利用灰樹花胞外多糖與維生素C聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)灰樹花D-組分對癌細胞表現(xiàn)出生長抑制。

研究表明，藥用真菌在發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥時，中藥成分不僅能刺激微生物生長，同時能參與到微生物的代謝之中，增加其次級代謝產(chǎn)物的生物活性[5-6]。本課題組前期研究結(jié)果表明，在灰樹花液體發(fā)酵體系中添加天麻醇提物及其主要成分天麻素、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲醇可顯著促進灰樹花產(chǎn)胞外多糖和菌絲體生長[7-10]，其促胞外多糖增產(chǎn)的機理與有效提高灰樹花胞外多糖合成酶酶活有關(guān)。本文希望通過研究加入了天麻醇提物的灰樹花發(fā)酵的變化，進一步探明灰樹花合成代謝產(chǎn)物胞外多糖變化機理、抑瘤活性、天麻醇提物對灰樹花代謝增效等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及培養(yǎng)基

灰樹花菌株(Grifolafrondosa，菌種編號：5.404)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；天麻(Rhizomagastrodiae)，貴州省德江縣天麻種植基地。

透析袋，Solarbio公司；甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖單糖標準品，上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨2，酵母膏6，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨5，酵母膏10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 2。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R型立式滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；ZWY-C2112B型雙層旋轉(zhuǎn)式可編程恒溫恒濕搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；Nicolet is50型原位漫反射傅里葉交換紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；CTFD-12S型真空冷凍干燥機，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀及檢測器、Agilent 5TC-C18型色譜柱，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1灰樹花培養(yǎng)方法

1)灰樹花菌株斜面培養(yǎng)。從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA斜面中部，25 ℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長滿整個斜面，轉(zhuǎn)置4 ℃保存。

2)灰樹花液體種子培養(yǎng)。用接種勺在斜面菌種管中取1勺細小菌絲體，接種于液體種子培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝液量為200 mL，加入少許細小玻璃珠，于25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)6 d。

3)灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)。無菌條件下，按10%的接種量，用移液槍取10 mL種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL，150 r/min搖床25 ℃培養(yǎng)。

1.3.2天麻醇提物制備與添加

天麻洗凈，55 ℃烘干，粉碎后過80目備用。準確稱取上述10 g的天麻粉末，加入100 mL體積分數(shù)為75%的乙醇。25 ℃浸提48 h后過濾，60 ℃減壓除去乙醇。加25 mL蒸餾水重溶后過濾，即得到2.5 mL/g的天麻醇提物(RG)。向灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)基中添加7 g/L的天麻醇提物，經(jīng)高壓高溫滅菌冷卻后，接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)12 d。

1.3.3灰樹花胞外粗多糖制備

取2 mL的去菌絲體發(fā)酵液，加入4倍體積95%無水乙醇，于4 ℃冰箱中醇析24 h，取出后4 000 r/min離心15 min，取沉淀物加體積分數(shù)95%乙醇沉淀3次后，于60 ℃數(shù)顯鼓風干燥箱中烘干即為粗多糖(CEPS)。

1.3.4灰樹花胞外粗多糖純化處理

上述醇析出的粗多糖用體積分數(shù)3%三氯乙酸脫蛋白，大孔吸附樹脂D303脫色，經(jīng)流水透析2 d，再經(jīng)蒸餾水透析1 d后，于真空冷凍干燥機中干燥，得到純化后的灰樹花胞外多糖樣品(PEPS)。

1.3.5灰樹花胞外多糖樣品中多糖及蛋白質(zhì)含量測定

取10 mg多糖樣品，用蒸餾水定容至50 mL，利用硫酸苯酚法[9]、考馬斯亮比色法[11]分別對樣品中多糖及蛋白質(zhì)含量進行分析。葡萄糖標準曲線線性回歸方程為：y=0.554 2x-0.003 5，R2=0.998 7。蛋白質(zhì)標準曲線為y=8.740 5x+0.009 3，R2=0.999 2。

1.3.6灰樹花多糖單糖組成測定

1)多糖樣品酸水解。分別稱取30 mg多糖樣品，用蒸餾水準確配成30 mg/mL的溶液，加入4 mol/L的三氯乙酸1 mL，充氮氣后密封，于110 ℃下水解2 h，冷卻后，加入甲醇2 mL，混勻后于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，重復3次，蒸干后加1 mL去離子水做衍生化反應(yīng)。

2)多糖樣品及單糖標準品1-苯基-3-甲基-5-吡啶碄酮(PMP)衍生化。參照文獻[12]，稱取甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖標準品各2 mg，加入去離子水于5 mL容量瓶中定容，取等體積單糖標準液配成濃度為0.4 mg/mL的單糖標準混合液。

取灰樹花多糖水解液及單糖標準品混合液各1 mL于10 mL離心管，加入1 mL 0.3 mol/L的NaOH，混勻后取上述混合液1 mL，添加1 mL 0.3 mol/L的PMP甲醇溶液，旋渦震勻后在70 ℃下反應(yīng)100 min，冷卻后用0.5 mL 0.3 mol/L HCl中和反應(yīng)液。加2.5 mL氯仿萃取，震搖、靜置，小心吸取水相(上層)，重復3次除凈PMP(此時氯仿層為無色)。0.45 μm濾膜過濾水相反應(yīng)液后用HPLC檢測。

3)多糖樣品HPLC檢測。色譜柱：Agilent 5TC-C18柱。流動相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.7)-乙腈，體積比為83∶17；柱溫30 ℃，流速為1 mL/s。進樣量20 μL，波長245 nm。

1.3.7紅外光譜實驗

取1～1.5 mg樣品與200～300 mg KBr(樣品與KBr質(zhì)量比約為1∶200)于瑪瑙研缽中研磨成混合均勻的粉末，用小藥匙轉(zhuǎn)入制片模具中于油壓機10 t壓力下保持2 min，撤去壓力后取出制成的供試片，目視檢測，應(yīng)呈透明狀，然后裝入樣品架上待檢。

1.3.8灰樹花胞外多糖生物活性檢測

抗腫瘤活性物質(zhì)篩選模型的檢測方法采用磺酰羅丹蛋白染色法(SRB法)，小鼠脾淋巴細胞增殖模型的檢測方法采用四氮唑鹽還原法(MTT法)?；覙浠ò舛嗵巧锘钚詸z測實驗由貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與生物活性研究中心完成。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)顯著性，Origin 7.5軟件作圖。在生物活性檢測實驗中樣品每個濃度平行3次，重復2次，結(jié)果以M±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖樣品中多糖及蛋白質(zhì)含量分析

灰樹花胞外多糖樣品主要由多糖組成(見表1)。經(jīng)提取純化后，使多糖成分進一步純化，其中蛋白質(zhì)成分無檢出，說明純化工序中脫蛋白徹底。

表1 胞外多糖樣品中多糖及蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)Tab.1 Polysaccharide and protein content of exopolysaccharide samples %

2.2 灰樹花胞外多糖的結(jié)構(gòu)特征分析

圖1 灰樹花胞外粗多糖、精多糖紅外光譜Fig.1 IR spectrum of CEPS and PEPS from G. frondosa

圖2 添加天麻的灰樹花胞外粗多糖、精多糖紅外光譜Fig.2 IR spectrum of CEPS-RG and PEPS-RG from Grifola frondosa

2.3 單糖混合標準品分析

甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖標準品的HPLC色譜圖和相應(yīng)的保留時間分別見圖3和表2。

圖3 單糖標準品色譜Fig.3 HPLC spectrum of mixed monosaccharides standards

2.4 灰樹花胞外粗多糖、精多糖單糖組成分析

添加天麻醇提物于灰樹花發(fā)酵體系為實驗組，未添加任何外源物的為對照組。添加天麻醇提物后灰樹花胞外粗多糖未產(chǎn)生新的單糖組成，但單糖物質(zhì)的量比改變顯著，見圖4、圖5及表3。樣品CEPS、CEPS-RG單糖組成中，葡萄糖含量最多，其次為甘露糖，同時檢出含量相對較少半乳糖，或還含有鼠李糖。這也進一步從單糖組成的角度解釋了紅外光譜中胞外粗多糖未檢測出明顯的α構(gòu)型的原因。

圖4 CEPS樣品色譜Fig.4 HPLC spectrum of CEPS from Grifola frondosa

圖5 CEPS-RG樣品色譜Fig.5 HPLC spectrum of CEPS-RG from Grifola frondosa

通過對比胞外多糖純品實驗組和對照組，發(fā)現(xiàn)檢測得到的灰樹花胞外多糖純品主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖組分構(gòu)成(見圖6、圖7)。其中，添加天麻醇提物對灰樹花胞外多糖單糖組分產(chǎn)生明顯變化，PEPS樣品中上述6種單糖物質(zhì)的量比依次為13.8∶3.9∶5∶3.7∶1∶1.7，而PEPS-RG樣品單糖組分物質(zhì)的量比12.7∶3.2∶5.6∶3.5∶1∶1.6(見表4)。通過對比單糖峰面積可知，天麻醇提物的加入能促進灰樹花分泌鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖成分。同時，由圖7可知，天麻醇提物的加入并未使灰樹花多糖產(chǎn)生新單糖組分。

表3 灰樹花胞外粗多糖單糖組成物質(zhì)的量比Tab.3 Monosaccharide mole ratio of crude exopolysaccharide in Grifola frondosa

圖6 PEPS樣品色譜Fig.6 HPLC spectrum of PEPS from Grifola frondosa

2.5 小鼠巨噬細胞(RAW264.7)活化實驗結(jié)果

篩選方法：酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)檢測巨噬細胞腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌表達。

圖7 PEPS-RG樣品色譜Fig.7 HPLC spectrum of PEPS-RG from Grifola frondosa

表4 灰樹花胞外精多糖單糖組成物質(zhì)的量比Tab.4 Monosaccharide mole ratio of pure exopolysaccharide in Grifola frondosa

模型原理：巨噬細胞在相關(guān)因素刺激下會活化，并分泌表達TNF-α。將樣品或脂多糖(LPS)加入巨噬細胞中培養(yǎng)一定時間后，取細胞上清液測定TNF-α的含量，判斷樣品對細胞的活化作用，計算公式見式(1)。

活化指數(shù)=ρ樣品(TNF-α)/ρ正常(TNF-α)。

(1)

PEPS-RG對巨噬細胞有明顯的活化作用，PEPS、CEPS-RG對巨噬細胞有一定的活化作用，CEPS對巨噬細胞無明確的活化作用(見表5)。由結(jié)果可知，添加天麻醇提物能促進灰樹花胞外多糖對巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)能力，Kim等[17]研究表明添加人參提取物能提高靈芝多糖對巨噬細胞的活化能力。這可能與天麻醇提物改變灰樹花胞外多糖單糖組成有關(guān)。通過對比經(jīng)純化和未經(jīng)純化的胞外多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7的作用可知，經(jīng)純化后的灰樹花胞外多糖對小鼠巨噬細胞有更強的活化作用，這可能與多糖經(jīng)純化后，具有生物活性的單糖含量增加有關(guān)。有研究表明多糖的單糖組成也與抗腫瘤活性相關(guān)，通常含有葡萄糖和甘露糖的多糖抗腫瘤活性較好，這主要是因為在人類巨噬細胞中已發(fā)現(xiàn)有葡萄糖和甘露糖受體，因而此種多糖具有高度特異性[18]。

表5 胞外多糖對小鼠巨噬細胞的作用Tab.5 Effect of exopolysaccharide on mouse macrophages cell

LPS為陽性對照。樣品標準稱量，按送樣方要求用生理鹽水溶解。

2.6 灰樹花胞外多糖抗腫瘤活性篩選實驗結(jié)果

篩選模型：人肝癌細胞HepG 2。篩選方法：四氮唑鹽還原法(MTT法)。

模型原理：活細胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色Formanzan；死細胞此酶消失，MTT不被還原。本模型根據(jù)MTT的還原程度，來檢測樣品對腫瘤細胞的作用情況，計算公式見式(2)。

抑制率=[(對照組OD值-樣品組OD值)/

對照組OD值]×100%。

(2)

所得的灰樹花胞外多糖樣品對人肝癌細胞HepG 2無體外抑制作用，見表6。造成該實驗結(jié)果的原因一方面可能是因為活性多糖的來源、產(chǎn)地、提取方法不同，體外抑瘤的效果會有差別，同一種多糖的不同級分或亞級分也會有不同的抑瘤效果[16]；另一方面或是因為與其他真菌多糖制劑類似，灰樹花多糖抗癌的機理并非是直接殺死腫瘤細胞，而是通過激活機體免疫系統(tǒng)，增加巨噬細胞的吞噬作用，促進免疫球蛋白的形成，提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化率并提高機體本身的抗病能力，從而達到抵抗癌細胞生長，防止腫瘤轉(zhuǎn)移，預防正常細胞癌變的目的[19]。許多動物實驗表明抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)物與激活免疫有關(guān)[20]。一般認為，藥用真菌的抗癌機理是多糖類成分，它可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)而間接地抑制腫瘤細胞[21-24]。多糖作為一種免疫增強劑，臨床上常與其他化療藥物聯(lián)用，用于治療腫瘤，如巖藻多糖與順鉬、泰莫西芬、紫杉醇聯(lián)用能增強對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞的抗腫瘤活性[25]。Kim等[26]發(fā)現(xiàn)在靈芝深層發(fā)酵體系中加入人參提取物后分離得到的多糖，能刺激免疫系統(tǒng)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，其體外抑制腫瘤細胞的活性可能與激活巨噬細胞，脾細胞和淋巴集結(jié)細胞有關(guān)。

表6 灰樹花胞外多糖對人肝癌細胞HepG 2的作用Tab.6 Effect of exopolysaccharide on human hepatoma HepG 2 cells

阿霉素為陽性對照，分子質(zhì)量為579.99。樣品準確稱量，按送樣方要求用生理鹽水溶解。

3 結(jié) 論

實驗對天麻醇提物加入至灰樹花液體發(fā)酵培養(yǎng)基后，所得到的胞外多糖單糖組成變化及抗腫瘤生物活性開展了研究。利用傅里葉紅外光譜對所得到的4種胞外多糖樣品進行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)純化的灰樹花胞外粗多糖相比，經(jīng)純化的胞外精多糖在875 cm-1、805 cm-1處有明顯的特征吸收。這可能是灰樹花多糖經(jīng)純化除雜后具有α構(gòu)型的單糖增加的緣故。

利用HPLC對4種胞外多糖樣品進行單糖組成分析，實驗結(jié)果表明，未純化的多糖樣品主要由葡萄糖、甘露糖及少量的半乳糖等單糖構(gòu)成，純化后的多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖構(gòu)成。同時，根據(jù)檢測結(jié)果可知，添加天麻醇提物對灰樹花胞外多糖單糖組分含量產(chǎn)生明顯變化，但并未使灰樹花多糖產(chǎn)生新單糖組分；PEPS樣品中其單糖物質(zhì)的量比甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖∶巖藻糖依次為13.8∶3.9∶5∶3.7∶1∶1.7，而PEPS-RG單糖組分物質(zhì)的量比12.7∶3.2∶5.6∶3.5∶1∶1.6。通過對比單糖峰面積可知，天麻醇提物的加入，能促進灰樹花分泌鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖等單糖成分。

對多糖生物活性進行檢測，由小鼠巨噬細胞(RAW264.7)活化實驗結(jié)果可知，PEPS-RG對巨噬細胞有明顯的活化作用，PEPS、CEPS-RG對巨噬細胞有一定的活化作用，CEPS對巨噬細胞無明確的活化作用。通過體外實驗檢測，發(fā)現(xiàn)4種多糖樣品對人肝癌細胞HepG 2無抑制作用。

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