不同產(chǎn)區(qū)甘草種質(zhì)資源類型的形態(tài)特征及分類學研究△

李文斌，羅琳，趙梓邯，王文全，2，3*，侯俊玲，3*，王文杰，張莉

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488；4.北京靈泉藥材研究所瀕危藥用植物資源保護基地，北京 101300)

甘草GlycyrrhizauralensisFisch.為豆科甘草屬多年生植物，廣泛分布于我國及俄羅斯、哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦等國家地區(qū)[1]，以根和根莖入藥，同時也是化妝、食品等行業(yè)的重要原料[2]。隨著野生甘草蘊藏量的急劇減少與人工栽培技術(shù)的成熟，栽培甘草已經(jīng)成為甘草藥材商品的主流，但甘草藥材質(zhì)量良蕎不齊的情況非常突出，由于栽培所用甘草種子主要來自于野生，因此將藥材質(zhì)量問題根本原因歸結(jié)于甘草的遺傳多樣性[3]。

遺傳多樣性是物種所有遺傳變異多樣性的總和，是生物多樣性的核心，同時也是分類學研究的基礎(chǔ)[4]。基因組DNA序列的變異是物種遺傳多樣性產(chǎn)生的基礎(chǔ)，而植株的外在形態(tài)是基因在特定環(huán)境下的表達。甘草種內(nèi)存在豐富的遺傳變異，在DNA分子研究中已經(jīng)得到證實[5-9]，同時亦有報道，不同種質(zhì)的甘草在部分外在性狀、化學成分方面存在顯著的差異[10-19]。魏勝利[20]對全國甘草種群進行了野外調(diào)查，以形態(tài)學和遺傳物質(zhì)為依據(jù)，將野生甘草種群劃分為新疆、西部、東部三類，且證明甘草種群間變異大于種群內(nèi)變異，但未對甘草種內(nèi)是否產(chǎn)生明顯分化做出說明，原因是不能排除環(huán)境因素的影響。因此，對甘草種質(zhì)資源的研究，尤其是在控制環(huán)境因素的條件下，對不同種質(zhì)資源類型甘草進行觀察研究，將有利于對甘草的遺傳變異與分化程度進行探討與研究。同時，為了解決甘草質(zhì)量不穩(wěn)定的問題，加快培育甘草新品種，依據(jù)野生甘草地上部分形態(tài)學性狀變異程度大的現(xiàn)狀[21]，以形態(tài)學入手，嘗試對甘草進行種下分類研究將更有利于甘草種質(zhì)的研究及其新品種的選育。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年7月12日，于北京靈泉藥材研究所瀕危藥用植物資源保護基地對處于結(jié)果期的甘草植株進行形態(tài)觀察，觀察對象為2010年以野生甘草橫生莖為繁殖材料移植的不同產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源類型的甘草植株(包括新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、陜西、吉林等6個省份的14個種質(zhì)資源類型)，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.。詳細信息見表1。

表1 14個種質(zhì)資源類型甘草基本信息

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查方法 2010年7月～10月期間，通過走訪調(diào)查，收集當?shù)匾吧什莸姆植紖^(qū)域信息。在實地調(diào)查時采用樣方調(diào)查，對不同生境(例如河邊、草場、田間地頭，林下)下的甘草群落分別取樣調(diào)查。每個產(chǎn)區(qū)設(shè)置樣方至少3塊以上，設(shè)置樣方面積為10 m×10 m，每個樣方收集十株甘草橫生莖作為繁殖材料。

1.2.2 移栽方法 每個產(chǎn)區(qū)的無性繁殖材料移植于北京靈泉藥材研究所瀕危藥用植物資源保護基地，移植前統(tǒng)一修剪為長度15～20 cm，移栽深度為20 cm；將同一產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源類型的地下莖移植于同一個小區(qū)內(nèi)，不同小區(qū)間設(shè)置1.5 m作為保護行，保護行種植玉米并每年進行割斷處理，以防止不同產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)資源類型甘草的地下莖走竄?；赝寥?、水分等環(huán)境條件一致，移植后進行統(tǒng)一的田間管理，以消除原來環(huán)境和材料個體大小(粗壯)對形態(tài)生長的影響。

1.2.3 數(shù)據(jù)收集方法 對甘草植株地上部分形態(tài)學性狀的測量方法參考魏勝利、于福來[12-13，22-24]等的測定標準，篩選莖表皮顏色、莖被覆物類型、葉尖形狀、果序形狀、果序緊實度、莢果形狀、莢果褶皺程度等7個質(zhì)量性狀(discrete characters)指標，株高、復(fù)葉長、果序長等14個數(shù)量性狀(quantitative characters)指標，為了更全面的描述甘草植株形態(tài)，依據(jù)實際調(diào)查情況，增加小葉長/小葉寬、實際果序長/果序?qū)?、株?株幅、株高/節(jié)間、株高/復(fù)葉長、實際果序長/序柄長等6個比例指標，共27個形態(tài)學指標用于分析。每個種質(zhì)資源類型隨機選取10株作為樣本進行形態(tài)學數(shù)據(jù)收集。

對質(zhì)量性狀進行編碼(見表2)：01莖表皮顏色：綠色1/莖基灰色2/全莖紅色3/莖基紅色4；02莖被覆物：硬刺毛1/腺點2/光滑3/柔毛4；03葉尖形狀：漸尖1/驟尖2/圓頓3；04果序形狀：球形1/圓柱形2；05果序緊實度：緊實1/松散2；果莢形狀：環(huán)形1/鐮刀2/微鐮刀3/線型4/念珠狀5；果莢褶皺程度：重褶皺1/輕褶皺2/扁平3/膨脹4。

表2 14個種質(zhì)資源類型甘草的7個質(zhì)量性狀編碼

1.2.4 統(tǒng)計方法 參考史傳奇[25]等的方法，應(yīng)用sas 8.2(最長距離法與ward法)構(gòu)建聚類樹。參照孫鵬[26]等的方法，應(yīng)用sas 8.2做主成分分析，求出各主成分的特征值、貢獻率、累計貢獻率及前6個主成分中各性狀特征的權(quán)重值，并基于前3個主成分繪制二維散點圖。利用Excel 2010、spss 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差分析

對14個種質(zhì)資源類型的140份甘草植株的20個數(shù)量性狀進行方差分析(見表3)，結(jié)果說明：株高、株幅、莖粗、側(cè)枝數(shù)、復(fù)葉長、小葉數(shù)上限、小葉數(shù)下限、小葉寬、果序長、果序?qū)?、序柄長、實際序長、實際果序長/果序?qū)?、株?株幅、株高/節(jié)間長、株高/復(fù)葉長、小葉長/小葉寬差異較大，均達到極顯著水平(P<0.01)；小葉長(P=0.015)、實際果序長(P=0.033)達顯著水平；節(jié)間長(P=0.075)、實際果序長/果序柄(P=0.663)不認為存在顯著性差異。

表3 14個種質(zhì)資源類型甘草20個數(shù)量性狀比較

續(xù)表3

2.2 聚類分析

采用最長距離法，基于20個數(shù)量性狀指標、7個質(zhì)量性狀指標對14個不同種質(zhì)資源類型的甘草進行聚類分析。聚類圖結(jié)果表明(圖1)，內(nèi)蒙古杭錦旗獨貴倒圖與甘肅華池的種質(zhì)資源類型優(yōu)先被分離，且甘肅華池種質(zhì)資源類型單獨為一支，說明這兩個種質(zhì)資源類型的地上部分形態(tài)差異明顯。其余12個種質(zhì)資源類型在SM(simple matching，簡單匹配系數(shù))為1.28時被分為兩支，其中內(nèi)蒙古杭錦旗巴音烏素、杭錦旗浩繞柴達木、磴口、新疆和靜、鞏留、吉林長嶺、寧夏同心縣紅寺堡7個種質(zhì)資源類型聚為一支，說明在同一環(huán)境下，這7個種質(zhì)資源類型的地緣關(guān)系被打破，并非以地理位置相近的種質(zhì)資源類型聚為一類。同時，寧夏靈武、韋州、鹽池、內(nèi)蒙古鄂前旗、陜西定邊被聚為一支，說明在同一環(huán)境下，部分種質(zhì)資源類型的地緣關(guān)系未被打破，這5個種質(zhì)資源類型集中分布在內(nèi)蒙古、寧夏、陜西3省交界處，表明該地區(qū)甘草地上部分形態(tài)相似程度高，變異程度小。

圖1 基于甘草20個數(shù)量性狀、7個質(zhì)量性狀的聚類分析樹狀圖

采用相同方法，基于20個數(shù)量性狀指標對14個不同種質(zhì)資源類型甘草進行聚類分析，結(jié)果表明(圖2)，聚類結(jié)果與圖1相似，甘肅華池種質(zhì)資源類型依舊優(yōu)先被分出，其余13個種質(zhì)資源類型在SM系數(shù)為1.50時聚為2支，與圖1相比，寧夏韋州被分到第一支，內(nèi)蒙古杭錦旗巴音烏素、新疆和靜種質(zhì)資源類型被分到第二支，說明不同種質(zhì)資源類型甘草以多基因控制、環(huán)境主導的數(shù)量性狀在同一環(huán)境下的表現(xiàn)存在顯著的差異，間接表明甘草種內(nèi)基因差異性較大，存在種下分類的可能性。

圖2 基于甘草20個數(shù)量性狀的聚類分析樹狀圖

采用ward法，基于7個質(zhì)量性狀指標對14個不同種質(zhì)資源類型甘草進行聚類分析，結(jié)果表明(圖3)，14個甘草種質(zhì)資源類型明顯分為2支，內(nèi)蒙古獨貴倒圖與甘肅華池的種質(zhì)資源類型依舊是距離最遠的兩個類型，且質(zhì)量性狀的聚類結(jié)果完全打破了地緣關(guān)系，說明14個種質(zhì)資源類型甘草以單基因控制的質(zhì)量性狀在表達上存在更顯著的差異。聚類結(jié)果可以明顯看出，在同一環(huán)境下以14個種質(zhì)資源類型甘草為代表的甘草地上部分形態(tài)特征存在顯著的差異，說明甘草種下存在明顯的遺傳變異且遺傳多樣性程度高，本研究選取的20個形態(tài)學數(shù)量性狀指標和7個質(zhì)量性狀指標有較好地區(qū)分作用，為甘草的種下分類提供了一定的理論依據(jù)。

圖3 基于甘草7個質(zhì)量性狀的聚類分析樹狀圖

2.3 主成分分析

對14個不同種質(zhì)資源類型甘草進行主成分分析，共提取了6個主成分，從主成分分析結(jié)果(表3)可以看出，主成分1、2、3、4、5和6的貢獻率分別為0.169 3%、0.148 8%、0.106 9%、0.090 1%、0.071 7%、0.068 1%，累計貢獻率為65.50%，包含了總變異的大部分，可以用這些相互獨立的因子來包括不同種質(zhì)資源類型間的形態(tài)差異。第1主成分中載荷較大(大于0.30)的是株高(0.326 4)、序柄長(0.380 0)，具有相近的絕對權(quán)重值，說明這2個數(shù)量性狀指標對甘草的種下分類均具有較高的分類價值；第2主成分中小葉寬(-0.365 8)、果序?qū)?-0.308 0)、實際果序長/果序?qū)?-0.333 2)、株高/株幅(0.321 5)，說明果序形狀指標與株型指標(株高/株幅)可以作為甘草種下分類的分類依據(jù)。第3主成分中小葉數(shù)上限(0.390 6)、小葉長(0.347 6)、葉尖形狀(-0.399 5)均具有較高的絕對權(quán)重值，說明小葉形態(tài)特征也可作為甘草種下分類的分類依據(jù)，其中葉尖形狀的載荷值最大，可見其具有一定的分類學價值；第四主成分中果序長(0.386 0)、實際果序長(0.442 2)，第五主成分中小葉數(shù)下限(-0.317 9)、株高節(jié)間長(0.373 4)、莖被覆類型(0.481 8)、莢果形狀(-0.336 7)，第六主成分中，實際果序長/序柄長(0.462 3)，后三個主成分的貢獻率相近，載荷量較大的指標中果序、莢果形態(tài)指標所占比例大，說明果序、莢果形態(tài)特征可作為甘草種下分類的依據(jù)，莖被覆類型的載荷量較大，也可作為一個潛在的分類指標。

表4 基于甘草27個性狀的主成分分析

基于第1主成分和第2主成分、第3主成分繪制二維散點圖(圖4、圖5)，散點圖呈現(xiàn)整體分布較分散、局部密集的特點，說明不同種質(zhì)資源類型的甘草地上部分形態(tài)有較大差異，有可能作為甘草種下分類的依據(jù)。第一主成分將14個種質(zhì)資源類型劃分為3類，其中甘肅華池、寧夏靈武、杭錦旗浩繞柴達木、內(nèi)蒙古鄂前旗、內(nèi)蒙古磴口分為一類，寧夏韋州、寧夏紅寺堡、杭景旗巴音烏素、陜西定邊分為一類，寧夏鹽池、吉林長嶺、杭景旗獨貴倒圖、新疆和靜、新疆鞏留為一類，說明甘草地上部分形態(tài)并非以地理區(qū)域分布為劃分依據(jù)，株高和序柄長有很高的分類學價值。在圖4中第二主成分可以將甘肅華池、寧夏靈武、杭錦旗浩繞柴達木、內(nèi)蒙古鄂前旗、內(nèi)蒙古磴口5個種質(zhì)資源類型分離，而未能將寧夏鹽池、吉林長嶺、杭景旗獨貴倒圖3個種質(zhì)資源類型分離，說明小葉寬、果序?qū)?、果序長/果序?qū)?、株?株幅對部分產(chǎn)區(qū)的甘草種質(zhì)資源類型具有分類學意義。在圖5中第三主成分可以將寧夏鹽池、吉林長嶺、杭景旗獨貴倒圖、新疆和靜、新疆鞏留劃分，卻未能將甘肅華池、內(nèi)蒙古磴口、杭錦旗浩繞柴達木及內(nèi)蒙古鄂前旗、寧夏靈武進行分離，說明小葉數(shù)上限、小葉長、葉尖形狀對甘草部分種質(zhì)資源類型具有一定的分類學意義。而第1、2、3主成分均未能將寧夏韋州、寧夏紅寺堡、杭景旗巴音烏素、陜西定邊進行分離，說明著四個種質(zhì)資源類型在地上部分形態(tài)上有非常高的相似性，變異程度小。

圖4 不同種質(zhì)資源類型甘草第一、第二主成分散點圖

圖5 不同種質(zhì)資源類型甘草第一、第三主成分散點圖

3 討論與結(jié)論

本研究選取20個數(shù)量性狀指標、7個質(zhì)量性狀指標，對140份材料進行分析和歸納。通過方差分析、聚類分析、主成分分析結(jié)果，從客觀角度證實了甘草種內(nèi)存在豐富的變異，此研究結(jié)果與前人報道基本一致[21，27-31]。同時，在此基礎(chǔ)之上，進一步探究了甘草種下分類的可能性，對27個性狀指標進行了分類學價值評估，篩選出株高、序柄長、小葉寬、果序?qū)?、實際果序長/果序?qū)挕⒅旮?株幅、小葉數(shù)上限、小葉長、葉尖形狀等具有分類學意義的性狀指標，其中株高、序柄長的分類學價值最高。

目前，栽培甘草藥材質(zhì)量不穩(wěn)定[32]，主要原因是栽培所用甘草種子基本來自于野生，而野生甘草表型變異分離極大，嚴重影響了藥材質(zhì)量的穩(wěn)定。盡管甘草豐富的變異被廣泛認可，但是否達到足以劃分出亞種或者變型的分化程度，還需要進一步研究，尤其是對于其子代的遺傳穩(wěn)定性方面。同時，從野生甘草的形態(tài)特征入手，輔以化學和分子技術(shù)手段，對甘草種下分類進行探索性研究，將有利于甘草種質(zhì)資源的快速掌握與優(yōu)良新品種的培育。

[1] Liu X，Hou W，Dou D.The Mealiness and Quality of Herbal Medicine：Licorice for Example[J].Pharmacognosy Res，2017，9(2)：151-155.

[2] 陸嘉惠，李學禹，馬淼，等.國產(chǎn)甘草屬植物的RAPD分析及其分類學研究[J].西北植物學報，2006(3)：527-531.

[3] 魏勝利，王文全，王繼永，等.我國不同產(chǎn)區(qū)野生與栽培甘草的甘草酸含量及其影響因子的初步研究[J].中國中藥雜志，2012(10)：1341-1345.

[4] 葛頌.什么決定了物種的多樣性?[J].科學通報，2017(19)：2033-2041.

[5] 孫群，佟漢文，吳波，等.不同種源烏拉爾甘草形態(tài)和ISSR遺傳多樣性研究[J].植物遺傳資源學報，2007(1)：56-63.

[6] 李貝寧，南博，劉春生，等.道地產(chǎn)區(qū)甘草遺傳多樣性的ISSR分析[J].實驗方劑學，2010(12)：90-93.

[7] 葛淑俊，李廣敏，馬峙英，等.甘草野生種群遺傳多樣性的AFLP分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2009(1)：47-54.

[8] 吳霞，劉慶華，馬永紅，等.新疆產(chǎn)甘草6個不同地理群體遺傳關(guān)系的RAPD分析[J].中國生化藥物雜志，2003(4)：191-193.

[9] 楊全，魏勝利，王文全，等.應(yīng)用cDNA-AFLP研究甘草不同變異類型特異表達的基因[J].中國中藥雜志，2009(13)：1628-1631.

[10] 魏勝利，王文全，王繼永，等.一年生甘草生長特性、甘草酸含量的地理變異及其生態(tài)學機制的初步研究[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2012(6)：406-411.

[11] 魏勝利，王文全，劉長利，等.一年生甘草藥材產(chǎn)量與甘草酸含量的廣義遺傳力及其遺傳相關(guān)性分析[J].中國中藥雜志，2012(5)：553-557.

[12] 魏勝利，王文全，劉春生，等.甘草野生種群地上植株形態(tài)地理變異及其生態(tài)學機制分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2011(S1)：4614-4618.

[13] 魏勝利，王文全，王繼永，等.甘草野生種群果實與種子形態(tài)特征的地理變異研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2011(23)：4460-4464.

[14] 楊全，魏勝利，王文全.甘草群體形態(tài)變異類型研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009(2)：34-36.

[15] 魏勝利，王文全，王繼永.不同甘草地理種群甘草酸含量的地理變異及其形成的生態(tài)學機制探討[C].中華中醫(yī)藥學會第九屆中藥鑒定學術(shù)會議，建德，2008.

[16] 魏勝利，王文全，秦淑英，等.甘草種源種子形態(tài)與萌發(fā)特性的地理變異研究[J].中國中藥雜志，2008(8)：869-873.

[17] 楊全，王文全，魏勝利，等.不同變異類型甘草中甘草苷及甘草酸量比較研究[J].中草藥，2007(7)：1087-1090.

[18] 楊全，王文全，魏勝利，等.甘草不同類型間總黃酮、多糖含量比較研究[J].中國中藥雜志，2007(5)：445-446.

[19] Song W，Qiao X，Chen K，et al.Biosynthesis-Based Quantitative Analysis of 151 Secondary Metabolites of Licorice To Differentiate Medicinal Glycyrrhiza Species and Their Hybrids[J].Anal Chem，2017，89(5)：3146-3153.

[20] 魏勝利.烏拉爾甘草地理變異與種源選擇[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2003.

[21] 王文全，吳慶豐.我國的甘草資源與甘草栽培技術(shù)[J].中藥研究與信息，2001(12)：18-20.

[22] 于福來，趙志剛，王文全，等.栽培甘草產(chǎn)量相關(guān)性狀遺傳潛力及選擇方法[J].中藥材，2013(10)：1551-1555.

[23] 于福來，王文全，侯俊玲，等.種質(zhì)與環(huán)境對二年生甘草群體主要生物活性成分的影響[J].中國中藥雜志，2013(10)：1479-1483.

[24] 于福來，方玉強，王文全，等.甘草栽培群體主要數(shù)量性狀遺傳變異及相互關(guān)系研究[J].中國中藥雜志，2011(18)：2457-2461.

[25] 史傳奇，劉玫，王臣.東北豆科山羊豆族4屬植物葉形態(tài)特征及數(shù)量分類學研究[J].草業(yè)學報，2015(5)：182-189.

[26] 孫鵬，馬波，趙文閣.北方須鰍4個地理種群的形態(tài)差異與判別分析[J].水產(chǎn)學雜志，2014(2)：14-19.

[27] 孫志蓉，王文全.新疆甘草資源保護利用對策[C].瀕危中藥資源保護利用戰(zhàn)略研討會，昆明，2000.

[28] 劉洋洋，劉春生，曾斌芳，等.甘草種質(zhì)資源研究進展[J].中草藥，2013(24)：3593-3598.

[29] 代少山.烏拉爾甘草種質(zhì)資源與藥材質(zhì)量研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學，2011.

[30] 姚輝.烏拉爾甘草遺傳多樣性與品質(zhì)評價及槲寄生的抗氧化活性成分[D].上海：復(fù)旦大學，2006.

[31] 佟漢文.烏拉爾甘草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2005.

[32] 黃明進，王文全，魏勝利.我國甘草藥用植物資源調(diào)查及質(zhì)量評價研究[J].中國中藥雜志，2010，35(8)：947-952.