微波輔助水解法測定魚鱗中羥脯氨酸

□ 姜 珊 王振雷 吉林省遼源市食品質(zhì)量安全檢測中心

魚鱗中的膠原蛋白是生物體內(nèi)一種重要的蛋白質(zhì)，也是結(jié)締組織的重要蛋白成分，水產(chǎn)膠原蛋白具有比陸生動(dòng)物膠原蛋白更高的安全性和更多的優(yōu)點(diǎn)。膠原中約50%的脯氨酸被羥基化成為4Hyp和少量3Hyp。作為氨基酸的主要組成部分而存在膠原蛋白中，約占膠原蛋白總量的10%，但不存在于一般蛋白質(zhì)中，通過測定羥脯氨酸的含量再乘以相應(yīng)的系數(shù)就可以得到膠原蛋白的含量。

本研究旨在找到一個(gè)微波輔助水解魚鱗測定魚鱗中羥脯氨酸的最佳實(shí)驗(yàn)條件，為魚鱗蛋白水解提供一個(gè)確切的羥脯氨酸測定標(biāo)準(zhǔn)，并為魚鱗中羥脯氨酸的開發(fā)利用提供一個(gè)科學(xué)有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4（國華電器有限公司）、電子天平FA2104（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、分光光度計(jì)723A（上海精密儀器科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

原料：新鮮鯽魚魚鱗。試劑：10%NaCl溶液、鹽酸、L-羥脯氨酸、高氯酸、醋酸鈉、檸檬酸三鈉、檸檬酸、異丙醇、對(duì)二甲氨基苯甲醛均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚鱗預(yù)處理及脫鈣

取新鮮鯽魚魚鱗，用10%的中性NaCl溶液浸泡10 h并去除雜蛋白和魚銀，晾干備用，加入0.4 mol/L的鹽酸進(jìn)行20 min脫鈣，烘干制粉備用。

1.3.2 試驗(yàn)試劑的配制

醋酸-檸檬酸緩沖溶液（PH=6）的配制：57 g醋酸鈉、37.5 g檸檬酸三鈉、5.5 g檸檬酸和385 mL異丙醇一起定容于1 000 mL容量瓶保存。測定前將7%氯胺-T溶液和醋酸檸檬酸緩沖液按1∶4體積混合，得氧化劑溶液（A液）。

顯色劑的配制：取10 g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于15 mL高氯酸水溶液中，于測定前將對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液和異丙醇3∶13體積混合，即顯色劑溶液（B液）。

1.3.3 標(biāo)樣曲線的繪制

稱取L-羥脯氨酸制0.054 5 g/L羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，溶液定容到10 mL容量瓶中，分別加入1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL 0.05 mol/L氯胺-T溶液，室溫（25 ℃）氧化10 min后，加入高氯酸1 mL，放置10 min，最后加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛顯色試劑1 mL，在65 ℃水浴顯色10 min，冷卻后在561 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 微波輔助法水解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別稱取5份10 g魚鱗樣品于250 mL錐形瓶中，加入20 mL鹽酸，放入微波爐中進(jìn)行微波處理。趁熱將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用10 mL鹽酸分三次洗滌錐形瓶，用水定容，搖勻。準(zhǔn)確移取6 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用水定容，加入3 mL氧化劑溶液（A液）氧化10 min后，加入高氯酸1 mL，放置10 min最后加入B液1 mL，在65 ℃水浴顯色10 min，冷卻后在最高吸收峰561 nm處測吸光度測定其吸光度。通過單因素和正交試驗(yàn)考察微波時(shí)間、微波功率、鹽酸濃度對(duì)測定羥脯氨酸的顯著影響，并確定水解條件的最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

計(jì)算其回歸方程為：

A=0.054*C+0.083

A——吸光度；C——羥脯氨酸濃度ug/mL；相關(guān)系數(shù)R=0.996

2.2 微波輔助水解魚鱗條件的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)表明，微波時(shí)間、微波功率和鹽酸濃度對(duì)羥脯氨酸濃度均有影響。因此，通過L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步研究它們的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1分析，可以看出微波輔助水解魚鱗測定羥脯氨酸的最佳工藝組合是A2B2C3和A2B1C3。A因素微波時(shí)間和C因素鹽酸濃度的Sig值小于0.05，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，B因素微波功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。通過驗(yàn)證試驗(yàn)A2B2C3的Hyp濃度為12.527，A2B1C3的Hyp濃度12.316，所以最佳水解條件組合為A2B2C3。

3 結(jié)論

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 正交試驗(yàn)表

微波輔助水解法測定魚鱗中羥脯氨酸的最佳試驗(yàn)條件是A2B2C3，即微波時(shí)間8 min，微波功率中低火480 W，鹽酸濃度7 mol/L，其中微波時(shí)間和鹽酸濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，微波功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。

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