標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)直腸腫瘤生物樣本庫(kù)的建立、管理及質(zhì)量控制的經(jīng)驗(yàn)探討

于洋 王貴玉，2

生物樣本庫(kù)在促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究中越來(lái)越重要，依托生物樣本庫(kù)可以實(shí)現(xiàn)結(jié)直腸腫瘤的早期診斷，早期預(yù)防和個(gè)體化治療。世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，全球結(jié)直腸腫瘤發(fā)病率和死亡率分別位于第三位和第四位。年確診新發(fā)患者約120萬(wàn)例，有近60萬(wàn)名患者死于結(jié)直腸癌［1］。手術(shù)治療是結(jié)直腸腫瘤的首選方法，經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本除病理診斷取材外全部予以銷毀，這造成極大地資源浪費(fèi)。隨著以人體腫瘤標(biāo)本作為研究的對(duì)象轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)進(jìn)步及個(gè)體治療理念的加強(qiáng)，在研究疾病的致病機(jī)制，探索有效治療手段，開發(fā)新的預(yù)防、診斷及治療方案和藥物等方面，對(duì)高質(zhì)量的人體結(jié)直腸腫瘤生物樣本的需求越來(lái)越高。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科作為診治結(jié)直腸腫瘤的專業(yè)科室，有豐富的腫瘤生物樣本資源，并且自2013年起就規(guī)范化、系統(tǒng)化的進(jìn)行腫瘤樣本的采集、處理及保存，且利用采集的生物樣本進(jìn)行了相關(guān)臨床課題的研究。雖然本科室已經(jīng)初步建立了一定規(guī)模的結(jié)直腸腫瘤生物樣本庫(kù)，但我國(guó)整體生物樣本庫(kù)的建設(shè)尚處于探索與進(jìn)步階段，沒(méi)有制定統(tǒng)一的收集與管理的標(biāo)準(zhǔn)與制度［2］?；诖?，現(xiàn)將哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科在建設(shè)與管理生物樣本庫(kù)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)分享如下。

資料與方法

一、樣本來(lái)源及倫理與知情

收集自2013年5月至2017年10月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科的結(jié)直腸腫瘤患者。腫瘤生物樣本包含人類的生物遺傳信息，對(duì)應(yīng)的臨床個(gè)人資料涉及個(gè)人隱私，對(duì)這些資源及信息的獲取涉及一些法律和倫理問(wèn)題［3］。因此，在充分尊重患者個(gè)人權(quán)益的情況下，經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，在患者入院及手術(shù)前，與患者及家屬進(jìn)行細(xì)致的講解與溝通，在獲得患者及家屬的理解與認(rèn)可情況下，簽訂相關(guān)采集與應(yīng)用患者腫瘤樣本組織、血液及個(gè)人臨床信息等資源的知情同意書 ，繼而進(jìn)行相應(yīng)樣本的采集處理。若患者不同意采集，絕不進(jìn)行任何的樣本收集工作 。所有樣本的采集均由經(jīng)病理科醫(yī)師培訓(xùn)與指導(dǎo)，且熟悉收集流程，熟練掌握生物樣本操作處理規(guī)范及質(zhì)量控制方法的人員完成 。

二、主要設(shè)備

-80 ℃超低溫冰箱（Thermo scientific 900 series），萬(wàn)格CoolBoxTMBB biocision 及ESKY ICE KING 6 L 低溫生物標(biāo)本轉(zhuǎn)移箱，腫瘤組織取材及處理器械，常規(guī)離心機(jī)，上海萬(wàn)格凍存管理系統(tǒng)MSI-FI、Brady IP300熱轉(zhuǎn)移二維碼打印機(jī)和掃碼槍，及相配套的臺(tái)式電腦，萬(wàn)格凍存管、凍存盒及凍存架等。

三、樣本采集

（一）組織樣本的采集、處理

術(shù)前簽署生物樣本取材知情同意書的患者。在術(shù)中與主刀醫(yī)生溝通，詳細(xì)記錄腫瘤組織熱缺血時(shí)間及離體時(shí)間，在保證病理科取材診斷的前提下進(jìn)行生物樣本的采集。專職的取材人員需在腫瘤組織離體30 min內(nèi)，分別取腫瘤組織（生理鹽水沖盡血液及表面附著污物）、癌旁組織（癌組織旁1～3 cm以內(nèi)）、正常組織（癌組織旁5 cm以外），每個(gè)取材部位取4～5塊組織，每塊組織大小約0.5 cm×0.5 cm，厚度小于0.5 cm，重量不小于2 g，分別裝入6個(gè)已標(biāo)記的無(wú)菌凍存管中，并迅速置于低溫生物樣本轉(zhuǎn)移箱中，于30分鐘內(nèi)存入-80 ℃超低溫冰箱中［4］，圖1。

圖1 離體腫瘤組織及各取材部位樣本

（二）組織樣本標(biāo)記及儲(chǔ)存

將手術(shù)室所取患者腫瘤組織的凍存管錄入萬(wàn)格生物樣本庫(kù)管理系統(tǒng)中的虛擬冰箱，每個(gè)凍存管生成唯一標(biāo)識(shí)的特定位置、特定信息的樣本編碼，并打印出圓形及長(zhǎng)條形兩種二維碼標(biāo)簽。將標(biāo)簽貼于凍存管上，圓形貼于凍存管帽上，長(zhǎng)條形貼于管身，隨后將凍存管置入與虛擬冰箱相對(duì)應(yīng)的-80 ℃ 超低溫冰箱中的對(duì)應(yīng)位置［5］。

（三） 生物樣本的質(zhì)量控制

建立標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的生物樣本庫(kù)，生物樣本的質(zhì)量保證是重中之重，只有高質(zhì)量的生物樣本才能為日后的科研實(shí)驗(yàn)與資源共享提供價(jià)值，故而在樣本的采集、處理、儲(chǔ)存及使用過(guò)程中嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)［6］。定期對(duì)取樣人員進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOPs）的培訓(xùn)，每年從所取樣本總數(shù)中抽取10例患者的癌組織、癌旁組織及正常組織做隨機(jī)的抽樣檢查，發(fā)現(xiàn)問(wèn)題解決問(wèn)題，確保所取標(biāo)本的質(zhì)量。

1.組織標(biāo)本病理學(xué)形態(tài)的質(zhì)控

從-80 ℃ 超低溫冰箱中取出冷凍組織標(biāo)本于室溫中解凍，對(duì)組織標(biāo)本塊進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、3～4 μm厚度切片、HE染色后，顯微鏡下觀察組織樣本的結(jié)構(gòu)變化，通過(guò)光學(xué)顯微鏡拍照，確認(rèn)取材部位與病理診斷是否一致，檢測(cè)組織標(biāo)本的代表性［7］。按照ICGC（國(guó)際腫瘤基因組協(xié)作研究）腫瘤組織樣本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞部分＞80%、壞死細(xì)胞＜20%為合格標(biāo)本。以上操作均由病理科經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)師完成。

2.組織標(biāo)本DNA的提取與鑒定

冷凍組織標(biāo)本DNA的提取按照購(gòu)買的基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作完成。基因組DNA提取以后，經(jīng)全波長(zhǎng)微孔板分光光度計(jì)測(cè)定DNA提取物的260 nm/280 nm的DNA濃度，并通過(guò)檢測(cè)所得A260/A280=1.6～2.0判斷DNA的純度。提取的DNA樣本用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察冷凍組織標(biāo)本DNA的完整性。

3.組織標(biāo)本RNA的提取與鑒定

冷凍組織標(biāo)本RNA提取方法參照購(gòu)買的RNA提取試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行。經(jīng)全波長(zhǎng)微孔板分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)稀釋的RNA提取物的260 nm/280 nm RNA的濃度，判斷RNA的純度［8］。提取的總RNA樣本經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)提取RNA的完整性，完整的總RNA顯示明亮的28 s和18 s條帶，并且28 s的亮度是18 s的2倍［9］。

4.積極完善組織樣本信息錄入

標(biāo)本組織與對(duì)應(yīng)臨床病歷信息及隨訪記錄的完整錄入是日后科研實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的基本保證。因?yàn)獒t(yī)院病歷信息的特殊性，患者的完整個(gè)人信息分別由醫(yī)院的HIS系統(tǒng)（hospital information system）及萬(wàn)格生物樣本庫(kù)管理系統(tǒng)組成。HIS系統(tǒng)中包含患者病歷資料，包括基本信息、出入院記錄、診療過(guò)程、住院病程、住院手術(shù)記錄、住院醫(yī)囑、檢驗(yàn)檢查及病理報(bào)告等信息。萬(wàn)格生物樣本庫(kù)管理系統(tǒng)包括：（1）樣本信息的錄入：樣本的標(biāo)識(shí)碼、患者姓名、病歷號(hào)、住院號(hào)、一般信息、醫(yī)保情況、手術(shù)信息、病理診斷、分期和隨訪情況等相關(guān)信息；（2）樣本使用管理：出庫(kù)日期、出庫(kù)人、標(biāo)本類型、名稱編號(hào)、精確位置、出庫(kù)狀況、出庫(kù)數(shù)量等信息；（3）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與查詢功能：包括數(shù)據(jù)的導(dǎo)入與導(dǎo)出，多種主題的數(shù)據(jù)查詢與統(tǒng)計(jì)等。為提高標(biāo)本存儲(chǔ)質(zhì)量，應(yīng)嚴(yán)格按照《腫瘤組織標(biāo)本庫(kù)及常用技術(shù)手冊(cè)》的相關(guān)規(guī)定，由專人負(fù)責(zé)組織標(biāo)本出入庫(kù)、臨床信息錄入及信息管理系統(tǒng)維護(hù)。規(guī)范操作流程，制訂標(biāo)本出入庫(kù)登記及使用申請(qǐng)等書面規(guī)定。

結(jié) 果

一、生物樣本的收集情況

截止2017年10月，本科室生物樣本庫(kù)共收集了440例患者的腫瘤組織480份、癌旁組織475份、正常組織475份及血液樣本398份共1 828份。但由于臨床樣本收集的復(fù)雜性與不確定性，在信息錄入時(shí)會(huì)存在一定的信息缺失情況。收集標(biāo)本部位及數(shù)量詳情見表1。所有患者的生物樣本在采集前都與患者本人或其授權(quán)委托人簽訂了知情同意書。

表1 收集標(biāo)本部位及數(shù)量（例）

通過(guò)萬(wàn)格生物樣本庫(kù)信息管理系統(tǒng)對(duì)患者信息進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，可以看出中分化腺癌在結(jié)直腸癌的分化程度中占有最大比例，約55%的患者在中期能夠發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療；在發(fā)病位置上來(lái)看直腸的發(fā)病比例最高，其次是相鄰的乙狀結(jié)腸，具體分布情況見圖2。

二、生物樣本質(zhì)量檢測(cè)情況

（一）病理質(zhì)控結(jié)果

隨機(jī)選取10例患者的腫瘤組織樣本，經(jīng)常規(guī)切片HE染色。HE染色結(jié)果顯示，所選取的組織切片腫瘤細(xì)胞形態(tài)良好，符合腫瘤細(xì)胞典型的病理特征（圖3）。切片中腫瘤組織面積均＞80%，高于ICGC標(biāo)準(zhǔn)，壞死組織面積均＜20%，低于ICGC標(biāo)準(zhǔn)。

（二）DNA質(zhì)量鑒定

抽提10例患者組織冷凍標(biāo)本的總DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析A260/A280均在1.6～2.0，將抽提的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見條帶清晰（圖4），無(wú)明顯DNA降解，證明所存儲(chǔ)標(biāo)本的DNA質(zhì)量良好。

（三）RNA質(zhì)量鑒定

抽提10例患者組織冷凍標(biāo)本的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析A260/A280均在1.8～2.0，將抽提的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，基本上可見明顯的28 s和18 s條帶（圖5），且28 s條帶的亮度為18 s亮度的1.5～2.0倍。提示RNA保存效果良好。

三、生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的建立

本研究參照國(guó)內(nèi)外生物樣本庫(kù)的建立與管理經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合科室實(shí)際狀況，建立了一套高效的從取材、保存、質(zhì)量控制及管理的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，完善了生物樣本庫(kù)的管理及應(yīng)用規(guī)范，同時(shí)科室醫(yī)生及研究生利用本樣本庫(kù)資源完成了相關(guān)課題的基礎(chǔ)與臨床研究，發(fā)表了數(shù)篇文章，生物樣本質(zhì)量使用效果回饋良好，能滿足實(shí)驗(yàn)課題項(xiàng)目的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

討 論

生物樣本庫(kù)在結(jié)直腸腫瘤的預(yù)防、治療及術(shù)后的繼續(xù)治療和治療方案的優(yōu)化中起著重要作用。生物樣本庫(kù)在21世紀(jì)的生物醫(yī)學(xué)研究的整個(gè)過(guò)程中有著巨大的創(chuàng)新潛力。西方國(guó)家最先開展人體生物樣本的采集與處理工作，并制定了一系列的生物樣本采集的標(biāo)準(zhǔn)化流程與生物樣本庫(kù)的管理制度，完善了生物樣本的質(zhì)量化控制。

生物樣本的質(zhì)量控制是樣本庫(kù)的關(guān)鍵［10］，其中腫瘤組織標(biāo)本采集是生物樣本庫(kù)的重中之重，它受多種因素影響，如患者的術(shù)前營(yíng)養(yǎng)及是否接受新輔助治療，術(shù)中失血量及體溫，手術(shù)方式及麻醉方式等［11］。因此在標(biāo)本采集的過(guò)程中必須要注意：1.應(yīng)按正常組織、癌旁組織、腫瘤組織順序依次采集，嚴(yán)格遵守?zé)o菌無(wú)瘤原則，為避免組織樣本自身污染及樣本間的交叉污染，每個(gè)部位采集完標(biāo)本的器械需用生理鹽水沖洗2～3次，充分洗凈組織殘?jiān)把海?.準(zhǔn)確區(qū)分腫瘤組織及壞死組織，保證所取樣本中腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量，能夠滿足日后科學(xué)研究使用。腫瘤組織離體時(shí)間與樣本入庫(kù)時(shí)間同樣是影響生物樣本基因表達(dá)的兩個(gè)關(guān)鍵因素，因此我們有專職工作人員配合手術(shù)醫(yī)生，確保腫瘤組織在離體后能在30 min內(nèi)存入-80 ℃ 超低溫冰箱中，避免細(xì)胞成分降解及DNA、RNA、蛋白等的異常表達(dá)，最大限度降低腫瘤組織供血切斷后對(duì)其生物基因穩(wěn)定性的影響［12］。在整個(gè)標(biāo)本采集的過(guò)程中，手術(shù)醫(yī)生、取材人員及病理科醫(yī)生需要通力協(xié)作才能最終保證整個(gè)樣本組織的質(zhì)量。

圖2 440例患者結(jié)直腸癌分化程度比例（左）發(fā)病位置比例（右）

圖3 隨機(jī)選取的腫瘤組織HE染色結(jié)果 圖 4 DNA瓊脂凝膠電泳圖 圖5 RNA瓊脂凝膠電泳圖。注：1、2代表癌組織，3、4代表癌旁組織，5、6代表正常組織

生物樣本儲(chǔ)存到冰箱后，定期對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確定其是否發(fā)生變性、降解等質(zhì)量問(wèn)題成為了建立標(biāo)準(zhǔn)化生物樣本庫(kù)工作的重點(diǎn)，因?yàn)楦哔|(zhì)量的結(jié)直腸腫瘤樣本是進(jìn)行科學(xué)研究的先決條件。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科的生物樣本庫(kù)樣本均由經(jīng)培訓(xùn)過(guò)的專職人員采集存儲(chǔ)錄入，并聯(lián)合病理科醫(yī)生一起確保所收集樣本的準(zhǔn)確性。筆者從哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科生物樣本庫(kù)現(xiàn)有樣本中隨機(jī)抽取10例進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，HE染色后觀察可見腫瘤細(xì)胞部分＞80%、壞死細(xì)胞＜20%，證明組織標(biāo)本取材準(zhǔn)確；對(duì)DNA檢測(cè)可見清晰明亮條帶，對(duì)RNA的提取及凝膠電泳結(jié)果顯示28 s和18 s條帶明亮清晰，DNA及RNA分子保存良好，無(wú)明顯降解。證明本科室目前收集存儲(chǔ)管理流程所收集的樣本質(zhì)量良好，能夠保證進(jìn)行一些科研實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

隨著經(jīng)驗(yàn)不斷積累及技術(shù)與觀念的日益革新，我們?cè)谏飿颖編?kù)的建設(shè)過(guò)程中也總結(jié)了一些問(wèn)題：（1）維持樣本庫(kù)運(yùn)轉(zhuǎn)的資金不足，樣本庫(kù)的建設(shè)需要大量的人力物力財(cái)力，目前維持運(yùn)轉(zhuǎn)的資金為個(gè)人課題基金，要想長(zhǎng)期建設(shè)大規(guī)模的生物樣本庫(kù)必須有醫(yī)院或科研機(jī)構(gòu)的資金支持；（2）場(chǎng)地有限，樣本庫(kù)建設(shè)需要一定的場(chǎng)地來(lái)擺放冰箱、樣本操作臺(tái)、離心機(jī)等設(shè)備，且要保證一定的室溫及充足的電力保障；（3）人員不足，操作及管理儀器設(shè)備需要大量人員，隨著樣本量的增加，人員略顯不足；（4）增加工作人員培訓(xùn)力度，現(xiàn)有工作人員流動(dòng)性大，因此對(duì)人員的管理與培訓(xùn)顯得尤為重要。每個(gè)人能否貫徹執(zhí)行腫瘤組織樣本的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程及規(guī)范化管理制度關(guān)系著樣本庫(kù)的建設(shè)質(zhì)量；（5）尚需建立一套完備的溫度控制報(bào)警系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)24小時(shí)對(duì)樣本庫(kù)的監(jiān)測(cè)報(bào)警，及時(shí)處理樣本庫(kù)出現(xiàn)的問(wèn)題，保證樣本的質(zhì)量；（6）對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移及其他的臟器轉(zhuǎn)移患者腫瘤病灶及腹水的收集保存尚不完善，需升級(jí)目前現(xiàn)有技術(shù)及設(shè)備，逐步實(shí)現(xiàn)對(duì)這些組織的收集及存儲(chǔ)。綜上所述，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科生物樣本庫(kù)尚有許多欠缺和不足的地方，需要不斷完善，但根據(jù)定期隨機(jī)抽取的生物樣本質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示，目前哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院結(jié)直腸腫瘤外科建立的生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程合理，所存儲(chǔ)的生物樣本能夠滿足相關(guān)科研實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)直腸腫瘤樣本庫(kù)可為研究結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及個(gè)體化治療和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)提供寶貴的臨床樣本資源，不僅可以縮短科研工作周期，加快醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化及研究進(jìn)程，還可確保科研工作的正確性和科學(xué)性，對(duì)促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)展具有十分重要的醫(yī)學(xué)意義。

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