基于轉(zhuǎn)錄組的楠木MYB轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及分析

丁蒙蒙 時(shí)小東 顧雨熹 代嬌 盛玉珍 徐鶯 莊國(guó)慶

摘 要：? 楠木（Phoebe zhennan）為樟科常綠喬木，是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹(shù)種。楠木生長(zhǎng)緩慢，木材形成所需周期較長(zhǎng)，其原因有待進(jìn)一步深入分析。近年來(lái)轉(zhuǎn)錄因子已成為植物分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子的挖掘和深入分析。該研究基于我國(guó)特有瀕危樹(shù)種楠木的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)與擬南芥基因組MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行對(duì)比，對(duì)楠木MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行挖掘和生物信息學(xué)分析，并結(jié)合功能預(yù)測(cè)和不同組織表達(dá)對(duì)其進(jìn)行深入分析。結(jié)果表明：從楠木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共挖掘出82個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，這82個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)所含氨基酸數(shù)目為50～1 121個(gè)、分子量為5.907～123.64 kDa，整體表現(xiàn)為親水性不穩(wěn)定蛋白，以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)分析表明，楠木MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域有高度保守性，含有[W]-X（19）-[W]-X（19）結(jié)構(gòu); 82個(gè)PzMYB可分為22類，參與生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、逆境響應(yīng)等過(guò)程，與功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果相一致。同時(shí)，在楠木莖和葉中，差異表達(dá)PzMYB數(shù)目為18個(gè)，其中上調(diào)10個(gè)、下調(diào)8個(gè)。該研究結(jié)果不僅對(duì)楠木MYB轉(zhuǎn)錄因子的挖掘和功能分析以及分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，而且還對(duì)其遺傳改良和分子育種具有參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 楠木， 轉(zhuǎn)錄組， MYB轉(zhuǎn)錄因子， 生物信息學(xué)， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：? Q943.2， S792.24

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2018）01-0090-11

Transcriptome-based excavation and analysis of MYB family transcription factors in Phoebe zhennan

DING Mengmeng1， SHI Xiaodong1， GU Yuxi1， DAI Jiao1， SHENG Yuzhen2， XU Ying1， ZHUANG Guoqing2*

（ 1. Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610064， China; 2. Sichuan Academy of Forestry， Chengdu 610081， China ）

Abstract：? Phoebe zhennan is an endemic valuable tree to China and listed as one of the national second-class protected wild plants. The growth rate of P. zhennan is too slow and the operating cycle is too long. To date， there is no reason to explain this phenomenon. These years have witnessed transcription factors becoming a focus on the researches about plants molecular biology， as the high-throughput sequencing technology has been well applied and developed. In the present study， the identification and phylogenetic analysis of the P. zhennan MYB （PzMYB） transcription factor family was performed and the expression profiles of these genes were determined. PzMYBs were identified from the P. zhennan transcriptome using bioinformatics tools， and their putative functions were determined based on the phylogenetic tree and classified into subfamilies using AtMYBs describing known functions. The results showed that 82 PzMYB transcription factors were excavated， and they encoded 50-1 121 amino acids， predicting hydrophilic and unstable. Their main structural elements were α-helix and irregular curl. Also， the sequence analysis and construction of phylogenetic tree showed that these MYB transcription factors had a certain conserved type， containing? [W]-X（19）-[W]-X（19）. Eighty-two PzMYB could be divided into 22 categories， and were related to the plant response to biotic stresses， cell development， secondary metabolism etc. Their involvements in response to stresses were reported by several transcriptional studies， which was precisely consistent with the functional prediction. Lastly， the members in the same subfamily had different spatial and temporal expression profiles， with genes in stems and leaves expressed at various levels， which was precisely consistent with the functional prediction. In stem， the numbers of differential expression of genes were eighteen， ten up-regulated and eight down-regulated in leaf. Based on the transcriptome data of P. zhennan， an endemic tree in China， we excavated and analyzed its MYB transcription factors， and provided valuable information for PzMYB gene cloning and functional characterization of P. zhennan. This research will lay a foundation for the study of molecular biology of P. zhennan and provide references for its genetic modification and molecular breeding.

Key words： Phoebe zhennan， transcriptome， MYB transcription factors， bioinformatics， gene expression

轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，是指與基因啟動(dòng)子順式作用原件發(fā)生相互作用，能調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一類蛋白質(zhì)。其特點(diǎn)為普遍含有寡聚化位點(diǎn)區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、核定位信號(hào)區(qū)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域（Liang et al，2005）。植物分子遺傳學(xué)的研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育，生理代謝，病原菌防御，細(xì)胞形態(tài)及模式建成等一系列生理過(guò)程以及對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)中起重要作用（Dubos et al，2010）。因此，利用轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物進(jìn)行各方面的調(diào)控具有良好前景。植物的次生生長(zhǎng)對(duì)植物自身機(jī)體機(jī)械支持、水分運(yùn)輸、抗逆，以及人類的生產(chǎn)活動(dòng)具有重要意義（田敏等，2007）。在眾多的轉(zhuǎn)錄因子家族中，NAC、WRKY、ERF、MYB等均參與植物的次生生長(zhǎng)的代謝調(diào)控（陳瑩等，2009）。Mitsuda et al（2005）發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，NST1（NAC secondary wall thickening promoting factor1，NST1）和NST2主要參與對(duì)花藥細(xì)胞次生壁增厚的調(diào)控，過(guò)表達(dá)的NST1的轉(zhuǎn)基因擬南芥中某些木質(zhì)素生物合成基因的表達(dá)增強(qiáng)。WRKY是通過(guò)結(jié)合植物次生代謝生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子元件進(jìn)而來(lái)調(diào)節(jié)代謝過(guò)程（Kakeshpour et al，2015）。MYB類轉(zhuǎn)錄因子則是參與植物苯丙烷類次生代謝途徑的調(diào)節(jié)（Geethalakshmi et al，2015）。在木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶的編碼基因的啟動(dòng)子上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)的AC元件，AC元件多存在于苯丙烷途徑基因的啟動(dòng)子區(qū)，一些MYB類轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合于此，從而參與木質(zhì)素生物合成，在次生細(xì)胞壁形成中具有重要的調(diào)控作用（Li et al，2015）。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是最大的植物轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，其共同特征是在其N端有一段51～52個(gè)氨基酸組成的MYB結(jié)構(gòu)域，各個(gè)MYB重復(fù)片段編碼三個(gè)α-螺旋，其中第二個(gè)和第三個(gè)的α-螺旋折疊為螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，可在特異識(shí)別位點(diǎn)與DNA的大溝結(jié)合（Hai et al，2012）。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)個(gè)數(shù)（R）將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4類。MYB轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、逆境脅迫應(yīng)答、次生生長(zhǎng)代謝以及葉片等器官的形態(tài)建成等生物學(xué)過(guò)程（Li et al，2014）。目前，MYB轉(zhuǎn)錄因子已在擬南芥、金魚(yú)草、大豆、煙草、蘋(píng)果、白樺、白楊等物種中分離并鑒定出來(lái)（Cao et al，2016）。Du et al（2012）對(duì)157個(gè)玉米MYB轉(zhuǎn)錄因子和125個(gè)擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析，結(jié)果表明有4個(gè)亞組的MYB轉(zhuǎn)錄因子與木質(zhì)素合成以及次生壁增厚有關(guān)。其中擬南芥AtMYB26的異源過(guò)表達(dá)促使木質(zhì)部增厚。劉慧子等（2016）從白樺MYB家族中鑒定了17條MYB家族基因，研究表明，絕大部分的MYB基因與形成層發(fā)育，木質(zhì)部形成相關(guān)。葉勝龍（2015）對(duì)毛白楊MYB055轉(zhuǎn)錄因子在次生壁合成中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MYB055的過(guò)量表達(dá)可使木質(zhì)部在莖中的異位沉積，提高毛白楊中木質(zhì)素的含量。對(duì)轉(zhuǎn)MYB055基因植株中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量分析得知，不僅苯丙氨酸代謝途徑上基本的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量有所上升，而且與木質(zhì)素合成途徑特異相關(guān)的關(guān)鍵酶基因、纖維素合成相關(guān)基因、木聚糖合成相關(guān)基因的表達(dá)量也都有所上升。上述研究表明，植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子可以參與木質(zhì)素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而調(diào)節(jié)植物木質(zhì)部形成，從而調(diào)節(jié)植物發(fā)育和木材形成。

楠木，又名楨楠，為樟科常綠喬木，是國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)樹(shù)種，也是我國(guó)的特產(chǎn)樹(shù)種（張煒等，2012）。其自然分布較少，現(xiàn)主要分布在貴州東北部，四川盆地西部的闊葉林中，在園林中，常作為庭蔭樹(shù)或行道樹(shù)。近年來(lái)，關(guān)于楠木的研究報(bào)道，多集中在楠木的育苗與栽培、病蟲(chóng)害防治、人工林生長(zhǎng)規(guī)律等的研究（杜娟和盧昌泰，2009）。這些研究結(jié)果表明，楠木生長(zhǎng)緩慢，木材形成所需周期較長(zhǎng)，其原因有待進(jìn)一步深入分析。因此，本研究從楠木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)入手，結(jié)合楠木不同組織高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子挖掘，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行分析，為楠木木材形成及發(fā)育研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

楠木種子采自四川省峨眉山，種植于四川省林業(yè)科學(xué)研究院基地。本研究分別取莖和葉為材料，迅速置于液氮中。將材料送北京百邁客生物科技有限公司，提取RNA后，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用Illumina HiSeqTM 2000 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)組織重復(fù)2次。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后采用Trinity（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/）軟件對(duì)經(jīng)過(guò)濾的高質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝獲得unigene序列。

1.2 方法

1.2.1 PzMYB序列鑒定與理化性質(zhì)分析 從擬南芥轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)Planttfdb（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）下載轉(zhuǎn)錄因子序列，并以此作為參考序列進(jìn)行對(duì)比;從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）下載MYB家族保守序列（PF00249），對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋，并剔除假陽(yáng)性序列。利用ExPaSy（http：// expasy.org/）對(duì)PzMYB編碼的氨基酸進(jìn)行一二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用ProtComp （http：//linux1.softberry.com/all.htm）、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/）對(duì)PzMYB編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽進(jìn)行分析。

1.2.2 PzMYB序列保守結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化樹(shù)分析 利用DNAMAN 5.0對(duì)PzMYB進(jìn)行多序列比對(duì);利用在線軟件MEME數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）對(duì)PzMYB進(jìn)行保守序列預(yù)測(cè)。利用從Planttfdb數(shù)據(jù)庫(kù)下載的擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子作為參考序列，運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建鄰接樹(shù)，構(gòu)建方法為Neighbor-Joining，Bootstrap 重復(fù)1 000次。

1.2.3 PzMYB序列的功能分析 運(yùn)用BlastX將含有PzMYB核苷酸序列對(duì)比到Non-redundant protein sequence database（Nr）、Nucleotide sequence database（Nt）、Gene Ontology database（GO）和The database of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)比參數(shù)為e<10-10，預(yù)測(cè)生物學(xué)功能。

1.2.4 PzMYB的表達(dá)模式分析 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用定量軟件RSEM進(jìn)行表達(dá)量水平評(píng)估，并利用FRKM值表示對(duì)應(yīng)Unigene的表達(dá)豐度。使用EBSeq進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得兩個(gè)樣品之間的差異表達(dá)基因集（FDR<0.01;Fold Change≥2）。將數(shù)據(jù)均一化后，使用R語(yǔ)言gplots程序包繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 楠木轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及生物信息學(xué)分析

基于楠木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，與擬南芥轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行對(duì)比分析，共對(duì)比出轉(zhuǎn)錄因子2 275個(gè)，涉及53種（表1）。其中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是數(shù)量最多的一類，共鑒定出489個(gè)，其次為NAC和MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，數(shù)量分別為374和147個(gè)。本研究主要對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行分析，對(duì)初步得到的147個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步分析，利用Pfam的MYB模型（PF00249）進(jìn)一步對(duì)比篩選，并于NCBI Conserved Domains對(duì)比，手動(dòng)去除冗余及不完整編碼序列等，共鑒定獲得82個(gè)序列含有MYB結(jié)構(gòu)。通過(guò)系列分析，從楠木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定出MYB家族序列82條。

82個(gè)PzMYB蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目在50～1 121之間，對(duì)應(yīng)分子量為5.908～123.636 kDa;其中有49個(gè)蛋白的理論等電點(diǎn)大于7，有33個(gè)小于7;pI最小值為4.68（PzMYB43），最大值為10.44（PzMYB69），所有蛋白的理論等電點(diǎn)平均值為7.76。從不穩(wěn)定系數(shù)來(lái)看，有10個(gè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40（穩(wěn)定蛋白），其他72個(gè)大于40（不穩(wěn)定蛋白），說(shuō)明楠木MYB轉(zhuǎn)錄因子家族整體是不穩(wěn)定蛋白。由脂肪系數(shù)可知，81個(gè)PzMYB蛋白質(zhì)小于100，為親水性蛋白;只有1個(gè)大于100（PzMYB80）。SOPMA分析表明，PzMYB蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)均含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴(kuò)展鏈和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。其中，23個(gè)以α-螺旋為主要構(gòu)成元件，以無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成次要元件;59個(gè)以無(wú)規(guī)則卷曲為主要構(gòu)成元件，以α-螺旋構(gòu)成次要元件;β-轉(zhuǎn)角和擴(kuò)展鏈所占百分比少。

ProtComp分析表明，82個(gè)PzMYB蛋白質(zhì)中共有67個(gè)（81.71%）定位在細(xì)胞核中;其余15個(gè)MYB成員定位在細(xì)胞質(zhì)中，可能參與細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。采用SignalP對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，82個(gè)PzMYB蛋白質(zhì)中，7個(gè)存在信號(hào)肽（PzMYB78、PzMYB4、PzMYB12、PzMYB13、PzMYB21、PzMYB27、PzMYB33），為分泌蛋白。信號(hào)肽位于分泌蛋白的N端，由15～30個(gè)氨基酸組成，在蛋白質(zhì)定位和蛋白移位中起著重要作用;其它PzMYB蛋白則不存在信號(hào)肽，這些蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中合成，不進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.2 PzMYB基因家族的結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN和MEME對(duì)PzMYB蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ确治龊捅Ｊ貓D繪制（圖1，圖2）。對(duì)于42個(gè)R1型MYB序列，其保守結(jié)構(gòu)域氨基酸數(shù)目為21～48個(gè)，R1保守基序類型為[W]-X（19）-[W]-X（19）-[W]，含有3個(gè)高度保守的色氨酸殘基（W），色氨酸殘基間隔19個(gè)氨基酸殘基序列。此外，含有相對(duì)保守的谷氨酸（E），甘氨酸（G），精氨酸（R）殘基。對(duì)39個(gè)R2R3型PzMYB進(jìn)行對(duì)比分析，得到含有60個(gè)氨基酸殘基的R2結(jié)構(gòu)域和含有39個(gè)氨基酸殘基的R3結(jié)構(gòu)域。R2結(jié)構(gòu)與R1結(jié)構(gòu)相似，也含有3個(gè)色氨酸殘基，且色氨酸殘基間隔19個(gè)氨基酸殘基。對(duì)于R1和R2，替代第一個(gè)色氨酸殘基的通常為苯丙氨酸（F）和亮氨酸（L）。同時(shí)，R2含有相對(duì)保守氨基酸殘基序列半胱氨酸（C）甘氨酸（G）賴氨酸（K）絲氨酸（S）半胱氨酸（C）精氨酸（R）亮氨酸（L）精氨酸（R），以及甘氨酸（G），谷氨酸（E），精氨酸（R）等保守氨基酸殘基。與R1和R2不同，PzMYB中R3保守結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)色氨酸殘基，均表現(xiàn)為高度保守，均未發(fā)生替換現(xiàn)象;此外含有多個(gè)高度保守氨基酸殘基，如亮氨酸（L），谷氨酸（E），甘氨酸（G），精氨酸（R）等。上述結(jié)果表明，PzMYB結(jié)構(gòu)域具有高度保守性，除了含有色氨酸殘基外，還含有其他保守氨基酸殘基和序列，這樣的結(jié)構(gòu)可以更好的維持PzMYB的螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)，從而與DNA分子進(jìn)行結(jié)合而發(fā)揮功能。

2.3 PzMYB系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多，基因功能種類繁多，且在擬南芥中研究較為透徹。為了比較系統(tǒng)的研究PzMYB蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系并預(yù)測(cè)其功能，采用MEGA5.10軟件構(gòu)建PzMYB和AtMYB進(jìn)化樹(shù)（圖3）?；跀M南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子劃分的25個(gè)亞家族（S1-S25），對(duì)PzMYB家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，由圖3可知，在S9、S10、S25這3個(gè)亞家族中未發(fā)現(xiàn)PzMYB家族蛋白，其余22個(gè)亞家族中均有PzMYB分布?；跀M南芥中的研究，PzMYB可主要分為以下幾類。

植物次生代謝方面，MYB轉(zhuǎn)錄因子在基因水平上研究最清楚的是黃酮類化合物的生物代謝途徑，它是苯丙烷類代謝途徑中的一個(gè)重要分支，主要參與黃酮類化合物的合成（李軍等，2016）。在擬南芥中，S4、S5、S6、S7亞家族參與花青素和黃酮類化合物合成途徑（Li et al，2016）。該亞家族中，涉及PzMYB48、PzMYB5、PzMYB34、PzMYB18、PzMYB50、PzMYB76和PzMYB31，其可能參與花青素和黃酮類化合物的合成。楠木的PzMYB22具有類似的功能，可能具有調(diào)控單寧酸的過(guò)程。

植物生長(zhǎng)發(fā)育方面，AtMYB58、AtMYB63、AtMYB72在擬南芥纖維和導(dǎo)管中激活木質(zhì)素的生物合成（Tak et al，2017）;AtMYB52、AtMYB54、AtMYB69、 AtMYB0/1能夠促進(jìn)纖維細(xì)胞中細(xì)胞壁的增厚（Omer et al，2013）。由此推測(cè)楠木PzMYB12、PzMYB15、PzMYB9、PzMYB16、PzMYB46、PzMYB41、PzMYB69、PzMYB71、PzMYB49、PzMYB53可能參與木質(zhì)素的生物合成及細(xì)胞壁的增厚等次生生長(zhǎng)過(guò)程。在擬南芥中，S15亞家族、S21亞家族、S3亞家族和S8亞家族參與木質(zhì)素的生物合成、次生細(xì)胞壁合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Guo et al，2017）?；诖?，PzMYB17、PzMYB14可能參與毛狀體的生成;PzMYB40、PzMYB32、PzMYB38、PzMYB4可能參與調(diào)控葉腋分生組織的表達(dá)。

植物抗逆性方面，擬南芥S18亞家族，S3亞家族，S22亞家族和S1亞家族參與非生物脅迫（Aoyagi et al，2014）（如高溫和干旱）和生物脅迫（如細(xì)菌、霉菌）（Zhang et al，2011）。通過(guò)聚類分析，在PzMYB中有16個(gè)與抗逆相關(guān)的AtMYB亞家族聚集在一起，涉及PzMYB77，PzMYB82，PzMYB70和PzMYB73等，說(shuō)明PzMYB轉(zhuǎn)錄因子可能參與楠木的脅迫響應(yīng)等生理過(guò)程。

2.4 PzMYB功能預(yù)測(cè)

利用BLAST軟件將含有PzMYB序列與Nr、Nt、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，獲得注釋文件。結(jié)果表明，82條PzMYB序列均得到注釋。在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)和KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中82條序列均得到注釋;其次是在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中，注釋條數(shù)為69條。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋數(shù)量為49條。GO分類注釋表明，注釋序列涉及23個(gè)GO分類。其中，注釋到分子功能（Molecular Function）、細(xì)胞組分（Cellular Component）和生物學(xué)過(guò)程（Biological Process）分類號(hào)分別為51、20、52個(gè)。在分子功能類中，主要與結(jié)合活性有關(guān)，注釋最多的GO分類為binding;在細(xì)胞進(jìn)程和生物學(xué)進(jìn)程類中，主要以cellular component和response to stimulus居多。綜合可知，PzMYB主要作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，其通過(guò)結(jié)合到DNA區(qū)域發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控功能，主要涉及植物的生物體生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝等過(guò)程。

2.5 PzMYB表達(dá)分析

從楠木高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中提取莖和葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得出PzMYB家族轉(zhuǎn)錄因子在組織中的表達(dá)量，并繪制熱圖（圖5）。圖5結(jié)果表明，PzMYB在組織表達(dá)模式上存在差異，大多數(shù)成員在莖和葉組織中均有表達(dá)，表達(dá)模式呈現(xiàn)多樣化。其中，在葉中表達(dá)的PzMYB有61個(gè)，在莖中表達(dá)的有70個(gè)。有8個(gè)PzMYB家族成員在葉組織中有表達(dá)，而在莖中不表達(dá);有17個(gè)在莖組織中有表達(dá)，而在葉中不表達(dá)。對(duì)莖葉中都表達(dá)的PzMYB進(jìn)行差異分析，結(jié)果表明在莖葉中差異表達(dá)PzMYB共18個(gè)，上調(diào)表達(dá)10個(gè)，下調(diào)表達(dá)8個(gè)（以葉片為對(duì)照組，莖為實(shí)驗(yàn)組）。其中，在莖中PzMYB4、PzMYB17、PzMYB26和PzMYB78的表達(dá)量高，而在葉組織中表達(dá)呈下調(diào);而PzMYB6、PzMYB65、PzMYB67和PzMYB72 PzMYB80、PzMYB58、PzMYB73和PzMYB63在葉片中表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)。根據(jù)表達(dá)模式推測(cè)，PzMYB4、PzMYB17、PzMYB26和PzMYB78可能參與楠木莖的次生生長(zhǎng)和木質(zhì)素合成等途徑;PzMYB31、PzMYB76可能參與楠木葉片的次級(jí)代謝、產(chǎn)物代謝和物質(zhì)合成等途徑，這也與功能預(yù)測(cè)相一致。后續(xù)可通過(guò)對(duì)PzMYB基因進(jìn)行克隆，并轉(zhuǎn)化模式植物等深入分析，進(jìn)一步驗(yàn)證挖掘的PzMYB功能。

3 討論與結(jié)論

由于木本植物雜合性強(qiáng)，基因組數(shù)據(jù)相對(duì)較大和復(fù)雜，很難在短時(shí)間內(nèi)獲得其全基因組數(shù)據(jù)信息，這嚴(yán)重制約了木本植物的相關(guān)研究（江香梅等，2014）。但是隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)更加準(zhǔn)確和快速。盡管與全基因組測(cè)序相比，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序具有一定的局限性，但是作為一種高效的方法廣泛應(yīng)用于植物研究，尤其是非模式植物。對(duì)于沒(méi)有參考基因組的木本植物，可以先采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等高通量測(cè)序技術(shù)構(gòu)建相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息，從而提供相應(yīng)的遺傳背景信息。本研究采用Illumina HiSeq2000平臺(tái)對(duì)楠木莖葉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到了豐富的基因信息和高質(zhì)量的拼接序列，為楠木及其近緣植物的生物學(xué)研究提供了有利的數(shù)據(jù)支持。同時(shí)，基于相關(guān)基因的分析，也為其問(wèn)題解決和后續(xù)研究開(kāi)展提供了參考和支持。

MYB基因家族是一類在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。在植物中，第一個(gè)MYB基因ZmMYBC1從玉米中克隆得到（馬婧等，2009），現(xiàn)已從擬南芥、金魚(yú)草、大豆、煙草、蘋(píng)果、白樺、白楊、梨等植物中已經(jīng)克隆上千個(gè)MYB家族序列（張麗等，2013），這為其他物種MYB基因家族的挖掘和分析提供了有利條件。本文正是基于前人的研究，利用課題組構(gòu)建的楠木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段，對(duì)MYB家族進(jìn)行分析，共鑒定出MYB家族基因82個(gè)，氨基酸數(shù)目在50～1 121之間，可能是由于可變剪切導(dǎo)致了不同基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)在基因全長(zhǎng)的比例呈現(xiàn)多態(tài)性（謝騰等，2014）。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，其主要元件為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲等;81.71%的PzMYB定位在細(xì)胞核中，這說(shuō)明大部分PzMYB可能與靶基因的DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合而發(fā)揮作用。同時(shí)對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，PzMYB基因家族具有高度保守性，含有兩個(gè)高度保守的色氨酸殘基以及氨基酸殘基間隔數(shù)目，第一個(gè)色氨酸殘基位置可被苯丙氨酸替代，這與其他報(bào)道結(jié)果相一致（Zhao et al，2014）

作為一種重要的模式植物，擬南芥中MYB家族基因功能研究較為清晰。對(duì)PzMYB與AtMYB進(jìn)行同源進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，研究PzMYB與擬南芥的進(jìn)化關(guān)系，從而對(duì)PzMYB進(jìn)行功能的預(yù)測(cè)，為后續(xù)的功能驗(yàn)證提供參考。基于同源性分析，與擬南芥S4-S7亞家族聚類的PzMYB48、PzMYB5、PzMYB34等7個(gè)PzMYB可能參與到花青素與類黃酮等物質(zhì)合成途徑中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。如PzMYB31可能轉(zhuǎn)錄激活類黃酮生物合成途徑中的CHS，CHI和FLS等上游基因，PzMYB18、PzMYB50可能與AtMYB75、AtMYB90功能類似，與bHLH等形成復(fù)合體，從而轉(zhuǎn)錄調(diào)控ANS等花青素合成途徑中的下游基因。同時(shí)，研究表明MYB家族與植物纖維素和木質(zhì)素等植物次生細(xì)胞壁合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，如過(guò)表達(dá)AtMYB46和AtMYB83通過(guò)調(diào)控上述物質(zhì)合成，導(dǎo)致次生細(xì)胞壁沉積（Zhou et al，2009）。由此推測(cè)，楠木中PzMYB12、PzMYB15、PzMYB9等10個(gè)可能參與楠木次生細(xì)胞壁的生成。楠木作為我國(guó)二級(jí)瀕危植物，其生長(zhǎng)緩慢，60 a才能進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，從而嚴(yán)重制約了楠木的發(fā)展和大面積種植，如果能夠運(yùn)用分子生物學(xué)的方法對(duì)其品種進(jìn)行改良和篩選，從而加速其生長(zhǎng)和次生物質(zhì)積累，將具有重要的意義。

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