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    不同茯苓菌株的質(zhì)量評價及遺傳關(guān)系鑒定

    2018-05-30 10:48:04吳勝蓮唐少軍靳磊邵晨霞楊祎賀月林
    南方農(nóng)業(yè)學(xué)報 2018年1期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)量評價茯苓菌株

    吳勝蓮 唐少軍 靳磊 邵晨霞 楊祎 賀月林

    摘要:【目的】評價不同茯苓菌株質(zhì)量并鑒定其遺傳關(guān)系,為茯苓菌株資源合理利用及優(yōu)良菌株選育提供參考?!痉椒ā恳?1株不同來源的茯苓菌株為研究對象,分別采用平面培養(yǎng)法測定其菌絲生長速率,松樹兜栽培法測定其菌核產(chǎn)量,反復(fù)轉(zhuǎn)接法測定其遺傳穩(wěn)定性。提取不同茯苓菌株的總DNA,PCR擴增ITS序列,進(jìn)行ITS序列分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。同時檢測菌株間的菌絲拮抗性,結(jié)合ITS序列分析結(jié)果進(jìn)一步鑒定茯苓菌株遺傳關(guān)系?!窘Y(jié)果】11個供試菌株中,8、9和12號菌株的菌絲生長速率、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性均較高,1、7和13號菌株較低。茯苓ITS序列長度為1600 bp,其序列分析結(jié)果顯示,1、2、3、4、7和10號菌株與Wolfporia cocos intemal transcribed spacer 1的同源性高達(dá)100%,8、9、11、12和13號菌株與W.cocos strain LP-13的同源性達(dá)99%,表明供試茯苓菌株屬于兩個不同的亞種。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,1、2、3、4、7和10號菌株聚為一類,菌株間的遺傳關(guān)系非常接近,存在同種異名的可能;8、9、11、12和13號菌株聚為另一類,菌株間的遺傳距離較大,存在種內(nèi)差異?!窘Y(jié)論】通過測定菌絲生長速度、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性評價茯苓菌株質(zhì)量切實可行,ITS序列分析可有效將茯苓菌株鑒定到種級分類單元,并明確茯苓菌株間的遺傳關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:茯苓;菌株;質(zhì)量評價;ITS序列;遺傳關(guān)系

    0引言

    【研究意義】茯苓(Poria cocos)隸屬于多孔菌科茯苓菌屬,寄生于松植物的根莖部位,是最早納入《中國藥典》的藥用食用菌之一(李燕等,2010),具有健胃、安神、抗癌、增強免疫力等功效(Lee et a1,2004;Chen et al,2010;Lee et al,2013;Sun,2014)。茯苓作為傳統(tǒng)中藥材,在中藥材中的配伍率達(dá)80%(張建逵等,2014)。近年來,茯苓產(chǎn)業(yè)化水平日益提升,優(yōu)良菌種是保障茯苓產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵,常通過誘變育種、雜交育種、分子育種等手段進(jìn)行選育和改良(彭衛(wèi)紅等,2005;Wu et al,2016;Xiang et al,2016),從而使其滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。但菌種分離、培育等方法存在一定差異,且國內(nèi)以相互引種替代新品種,導(dǎo)致菌種質(zhì)量不一致。因此,建立一套茯苓菌株質(zhì)量評價體系,鑒別茯苓菌株問的生物遺傳學(xué)差異,明確其遺傳關(guān)系,對茯苓優(yōu)良菌株的選育與改良具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,國內(nèi)外有關(guān)茯苓的研究主要集中在營養(yǎng)成分和藥理上,對其種質(zhì)特性研究較少。熊杰等(2006)對茯苓菌絲體、子實體和擔(dān)孢子的形態(tài)特征及適宜的生長發(fā)育條件進(jìn)行了研究,但未對茯苓菌株的質(zhì)量作出系統(tǒng)評價。謝賢安等(2008)利用ISSR分子標(biāo)記對8個不同來源的茯苓菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析,將所有供試菌株完全區(qū)分開來,發(fā)現(xiàn)其具有豐富的遺傳多樣性。蔡丹鳳(2013)利用RAPD分子標(biāo)記對國內(nèi)14個茯苓當(dāng)家栽培菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析,并對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的8個茯苓菌株進(jìn)行結(jié)苓對比,結(jié)果篩選出優(yōu)良菌株川杰1號-A5,其結(jié)苓早,產(chǎn)量高。蔡志欣等(2013)利用SRAP分子標(biāo)記對福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏的32個茯苓菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10對引物擴增獲得23條特異性條帶,其中31個茯苓菌株遺傳相似系數(shù)較高,表明茯苓菌株遺傳背景較窄。徐雷等和陳科力(2014)從我國各地收集12個茯苓菌株并開展栽培試驗,篩選出適合湖北產(chǎn)區(qū)栽培且具有較高經(jīng)濟效益的優(yōu)良菌株。【本研究切入點】ITS序列分析以其高效率、高準(zhǔn)確率而廣泛應(yīng)用于近緣種的分類與鑒定。黃龍花等(2009)將ITS序列分析與堿基比對相結(jié)合對鳳尾菇的分類地位及拉丁名進(jìn)行研究,結(jié)果證實ITS序列分析在近緣種的分類鑒定上具有較高應(yīng)用價值。但至今鮮見通過ITS序列分析系統(tǒng)評價茯苓質(zhì)量并利用菌株問的遺傳關(guān)系辨別同種異名的研究報道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】測定不同來源茯苓菌株的菌絲生長速度、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性,對其質(zhì)量進(jìn)行評價,并分析菌株問的遺傳關(guān)系,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,為茯苓菌株資源合理利用及優(yōu)良菌株選育提供參考。

    1材料與方法

    1.1試驗材料

    供試茯苓菌株編號及來源見表1。Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、質(zhì)粒提取試劑盒和1 kb DNALadder Maker均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

    1.2試驗方法

    1.2.1菌絲生長速率測定采用打菌塊法將茯苓菌株接種于含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中,正置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d后,每8h測量菌落直徑,直至菌落長滿培養(yǎng)皿,并計算菌絲生長速率(菌落直徑/培養(yǎng)天數(shù))。

    1.2.2菌核產(chǎn)量測定采用松樹兜栽培法栽培茯苓(蔡丹鳳等,2007),栽培9個月后采收,測定每個菌核的重量,以單株菌核的總重量作為菌核產(chǎn)量。每菌株設(shè)3次重復(fù)。

    1.2.3遺傳穩(wěn)定性測定采用打菌塊法將茯苓菌株接種于含PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑9cm)中,正置于26℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),菌絲長滿后為第1代種,再用同樣方法將菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA固體培養(yǎng)基上,菌絲長滿后為第2代種,如此反復(fù)轉(zhuǎn)接7代,將第7代菌絲以打孔法接種(7塊菌塊)至搖瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,同時以第1代為對照,25℃下150r/min振蕩培養(yǎng)7d。離心收集菌絲球,60℃烘干至恒重,用電子天平精確稱重,測定其生物量大小。3次重復(fù),取平均值。

    1.2.4總DNA提取采用改良的氯化芐法(朱衡等,1994)提取茯苓總DNA:用液氮將茯苓菌絲研磨成粉末后,轉(zhuǎn)移至5mL離心管中,加入1mL抽提液(100 mmol/L Tris-HCl,40 mmol/L EDTA,pH 8.0)振蕩混勻,加入0.2μL10%SDS、800.0μL氯化芐和1.0μL RNA酶(2.5 U/L)后劇烈振蕩,50℃保溫1 h(每隔10 min劇烈振蕩一次),加入200μL 3 mol/LNaAC(pH 5.2)混勻,冰浴10 min,室溫下8000 r/min離心5 min,取上清液,加入等體積異丙醇,室溫放置5 min,1000 r/min離心3 min,棄上清液,沉淀用2 mL 70%乙醇洗滌(確保沉淀懸浮起來),自然風(fēng)干,溶于30μL無菌水中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.5ITS序列擴增以提取的總DNA為模板,采用通用引物ITS 1(5'-TCCGTAGGTGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')PCR擴增ITS序列。反應(yīng)體系30.0μL:10xPCR Bu-ffer 5.μL,DNA模板2.0μL,Taq DNA聚合酶2 U,dNTP 3.0μL,正、反引物各1.0μL,以無菌去離子水補足至30.0μL。擴增程序:94℃預(yù)變性3 min,94℃45 s,55℃45 s,72℃90 s,進(jìn)行32個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃終止反應(yīng)。取2.0μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

    1.2.6重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化將PCR擴增獲得的ITS序列連接至pMDl8-T載體,轉(zhuǎn)入大腸桿菌top10后,提取陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

    1.2.7ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建將ITS序列測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST比對,從中獲取與供試茯苓菌株親源關(guān)系較近的模式菌株ITS序列。運用MEGA 3.1和ClustalX 1.81,采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

    1.2.8菌株間的菌絲拮抗性檢測將茯苓菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基,每個平皿接3種茯苓菌株,28℃培養(yǎng)至菌絲覆蓋整個平皿,觀察各菌株問的菌絲是否有拮抗線。結(jié)合ITS序列分析結(jié)果進(jìn)一步鑒定茯苓菌株,以確認(rèn)ITS序列分析分類的菌株問是否具有菌絲拮抗性。

    1.3統(tǒng)計分析

    利用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1茯苓菌株菌絲生長速率及菌核產(chǎn)量測定結(jié)果

    由表2可看出,所有茯苓菌株的菌絲生長速度均較快,5 d即可長滿培養(yǎng)皿,但不同茯苓菌株的菌絲生長速率和菌核產(chǎn)量存在明顯差異,其中以8號菌株的菌絲長勢最好,菌絲潔白,氣生菌絲粗壯濃密,生長速率最高,達(dá)1.82 cm/d,其次是12號(1.80 cm/d)和9號菌株(1.78 cm/d),而1號菌株最低,僅1.60 cm/d,且菌絲較稀疏;菌核產(chǎn)量也以8號菌株最高,達(dá)6.76 kg,其次為12號(6.04kg)和9號菌株(5.76kg),以1號菌株最低,僅5.08 kg;8、9和12號菌株的菌核形狀規(guī)則、肉質(zhì)純白,無泡苓、砂苓及跑苓現(xiàn)象,結(jié)實程度(比重)較好,1、7和13號菌株呈不規(guī)則狀,有泡苓現(xiàn)象,質(zhì)量較差。

    2.2茯苓菌株遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果

    將各菌株傳代前后的生物量進(jìn)行比較,結(jié)果如表3所示,2、3、4、8、9、10、11和12號菌株的第7代與第1代發(fā)酵生物量無顯著差異(P>0.05,下同),但1、7和13號菌株的第7代發(fā)酵生物量顯著降低,表明1、7和13號菌株的遺傳穩(wěn)定性較差,不適合用于發(fā)酵生產(chǎn)。

    2.3茯苓總DNA的提取結(jié)果

    利用改良的氯化芐法能有效提取茯苓總DNA,省時省力,且提取的茯苓總DNA條帶清晰(圖1),性質(zhì)穩(wěn)定,無干擾條帶,純度高,可作為PCR擴增ITS序列的DNA模板。

    2.4茯苓ITS序列擴增及比對分析結(jié)果

    茯苓ITS序列PCR擴增結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物條帶單一且清晰,大小約1600 bp,與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。將PCR產(chǎn)物雙向測序后進(jìn)行拼接,發(fā)現(xiàn)茯苓ITS序列大小為1600 bp。將其在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似菌株共有4個,其中1、2、3、4、7和10號菌株與W.cocos intemal tran-scribed spacer 1的同源性高達(dá)100%,8、9、11、12和13號菌株與W.cocos strain LP-13的同源性達(dá)99%。因此,初步鑒定供試茯苓菌株屬于兩個不同的亞種。

    2.5茯苓菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

    從構(gòu)建的茯苓菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)可知,1、2、3、4、7和10號菌株聚為一類(Group 1),且和4個相似菌株在同一個分支上,表明1、2、3、4、7和10號菌株與4個相似菌株的同源性較高,菌株問的遺傳距離為0,存在著同種異名的可能;而8、9、11、12和13號菌株聚為另一類(Group 2),與4個相似菌株均不在同一個分支上。Group 1和Group 2遺傳差異大,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),且Group 2菌株問的遺傳距離也較大,存在種內(nèi)差異??梢姡谙到y(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可篩選出遺傳差異較大的菌株,為茯苓菌種選育提供親本材料。

    2.6茯苓菌株間的菌絲拮抗性檢測結(jié)果

    選取1、2、3、8和12號菌株進(jìn)行菌絲拮抗性檢測,結(jié)果表明,茯苓1、2和3號菌株間無菌絲拮抗線,進(jìn)一步證實茯苓1、2和3號菌株存在同種異名的可能;但1、2、3號菌株與8、12號菌株間有菌絲拮抗線,表明茯苓1、2、3號和8、12號菌株存在種屬差異,屬于兩個不同的亞種,與茯苓ITS序列分析結(jié)果一致。說明茯苓菌株問的菌絲拮抗性可用于鑒別菌株間遺傳關(guān)系。

    3討論

    目前,食用菌菌種雜而混亂,菌種制備不規(guī)范,菌種退化且同種異名現(xiàn)象普遍存在,嚴(yán)重影響食用菌產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展,因此,加強食用菌菌株質(zhì)量評價對食用菌的生產(chǎn)和育種具有重要意義。其中,菌絲生長速率、菌核產(chǎn)量、遺傳穩(wěn)定性等生物學(xué)特性是評價食用菌菌種質(zhì)量的重要指標(biāo)(王振福,1997)。本研究通過對不同來源茯苓菌株的菌絲生長速率、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),8、9和12號菌株較優(yōu)質(zhì),菌絲潔白粗壯、生長速度快、質(zhì)地致密、菌絲爬壁能力強,具有濃郁、特殊的茯苓芳香味,尤其是8號菌株,其生長速率和菌核產(chǎn)量均高于其他菌株,且遺傳穩(wěn)定性較高,可應(yīng)用于實際生產(chǎn);而1、7和13號菌株培養(yǎng)6 d后菌絲褐化,培養(yǎng)基有色素產(chǎn)生,且菌核產(chǎn)量較低,遺傳穩(wěn)定性較低,質(zhì)量較差,不適用于生產(chǎn)。

    菌株生物學(xué)特性能反應(yīng)菌種質(zhì)量的優(yōu)劣,但無法鑒定菌株的種屬及遺傳關(guān)系,難以鑒別是否同種異名。由于茯苓無菌絲鎖狀聯(lián)合且子實體形成時間長(Lindner and Banik,2008),缺乏可靠的形態(tài)學(xué)和生化鑒定指標(biāo),對茯苓菌株種屬鑒定較困難。但通過ITS序列分析和BLAST比對研究茯苓菌株間的基因差異,能簡便、快速、客觀地揭示其遺傳關(guān)系(Leeet al,2000;Atsumi et al,2007)。本研究通過ITS序列分析鑒別茯苓菌株問的遺傳關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)11株茯苓菌株可分為兩個大類,1、2、3、4、7和10號菌株聚為一類,且遺傳距離非常接近,其同源性為100%,推測可能為同一個種,存在同種異名的可能;8、9、11、12和13號菌株聚為另一類,菌株問的遺傳距離較大,菌株間存在種內(nèi)差異。兩個大類遺傳差異較大,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外,在大多數(shù)真菌中存在不親和性,其是一種識別異己的遺傳系統(tǒng),能引起反應(yīng)區(qū)產(chǎn)生拮抗反應(yīng)(潘麗晶等,2013)。本研究利用這一原理對不同茯苓菌株進(jìn)行菌絲拮抗性檢測,結(jié)果表明,1、2、3號菌株與8、12號菌株存在種屬差異,屬于兩個不同的亞種,與茯苓ITS序列分析結(jié)果一致??梢姡覈蜍呔甑倪z傳差異不明顯,需加大茯苓菌種資源的保護及研究力度,促進(jìn)茯苓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

    4結(jié)論

    通過測定菌絲生長速度、菌核產(chǎn)量和遺傳穩(wěn)定性評價茯苓菌株質(zhì)量切實可行,ITS序列分析可有效將茯苓菌株鑒定到種級分類單元,并明確茯苓菌株問的遺傳關(guān)系。

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