硒對銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特性的影響

朱娟娟 馬海軍

摘要：【目的】探討亞硒酸鈉（Na₂SeO₃）對銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特性的影響，為揭示硒元素緩解釀酒葡萄幼苗銅脅迫作用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳詫幭馁R蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)淡灰鈣土在溫室中盆栽釀酒葡萄赤霞珠，分析添加外源硒（1.0 mg/kg）對銅脅迫（300.0 mg/kg）釀酒葡萄幼苗葉片光合色素含量、抗氧化酶[過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）]活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白含量的影響。【結果】與對照（CK）相比，1.0 mg/kg硒處理能提高釀酒葡萄幼苗葉片的葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和總葉綠素（Chl a+b）含量及POD和CAT活性，降低MDA含量，但對SOD活性和可溶性蛋白含量無顯著影響（P>0.05）；300.0 mg/kg銅脅迫可顯著降低葡萄幼苗葉片的葉綠素（Chl）和可溶性蛋白含量（P<0.05，下同），提高Chl a/b、抗氧化酶活性及MDA含量；1.0 mg/kg曬+300.0 mg/kg銅處理的葡萄幼苗葉片Ch1和可溶性蛋白含量與CK相當，但均高于300.0 mg/kg銅脅迫處理，SOD、POD和CAT活性比300.0 mg/kg銅脅迫處理略有降低，MAD含量顯著低于300.0 mg/kg銅脅迫處理。【結論】銅脅迫條件下，低濃度（1.0 mg/kg）硒元素能提高釀酒葡萄幼苗對逆境的耐受力，提高葉片抗氧化酶活性，降低葉片細胞膜質過氧化程度，進而緩解銅對葡萄幼苗的毒害作用。

關鍵詞：釀酒葡萄；銅脅迫；硒；光合色素；抗氧化酶活性

0引言

【研究意義】銅是植物生長發(fā)育必需的微量元素，其制劑是果樹上使用最多的一類殺菌劑。但銅屬于無機元素，在環(huán)境中移動性差，不可降解，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中銅制劑的大量長期施用，銅脅迫對葡萄園生態(tài)環(huán)境已產(chǎn)生積累性污染（卜元卿等，2013；徐秋桐等，2014），直接影響葡萄的生長發(fā)育及果實和葡萄酒的品質。大量研究表明，過量的銅抑制植物光合作用和呼吸作用，降低酶活性，誘發(fā)細胞內活性氧產(chǎn)生，加速H²O²向毒性更強的O^2-轉化，增加膜透性，導致細胞內物質外滲，代謝失調，破壞DNA結構，進而導致植株生長受阻（肖志華等，2012；楊昱和秦樊鑫，2014）。硒元素對高等植物的生長發(fā)育具有重要的生理和功能性作用（Gasecka et al，2016），低濃度硒可調控植物的光合和呼吸作用，促進植株生長發(fā)育，提高體內營養(yǎng)成分含量，改善農(nóng)產(chǎn)品品質及增強植物抗逆性（朱麗琴等，2007；Proiettia et al，2013）。同時，硒元素不僅能增強殺菌劑的殺菌作用，還具有抗氧化作用并拮抗環(huán)境毒害、減少植物對重金屬的吸收，從而保護植物免受重金屬毒害（Li et al，2012）。因此，探討外源硒（Na²Se0³）對銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特性的影響，對實際生產(chǎn)中提高釀酒葡萄果實硒含量、改善其品質及緩解銅脅迫的毒害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】林義章等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫小白菜的葉綠體結構發(fā)生變形，基質類囊體結構膨脹，隨著銅含量的增加，細胞膜逐步瓦解，葉綠體的基粒消失。銅元素除對植物光合作用產(chǎn)生顯著影響外，對植物體根系發(fā)育及養(yǎng)分吸收等也有顯著影響（Lomnardi and Sebastiani，2005）。此外，葡萄酒釀造過程中，原料中過量的銅不但影響酵母的存活率，而且顯著影響酵母對還原糖的發(fā)酵性能，最終影響CO²和酒精的產(chǎn)量（王巧碧等，2016）；同時，葡萄酒中銅過量還會加速酚類物質的氧化，導致葡萄酒產(chǎn)生金屬破敗（Sun et al，2016），降低葡萄酒質量。葉面噴施硒元素能提高葡萄（朱麗琴等，2007）、蘋果（寧嬋娟等，2013）和梨（王斐等，2014）等果實的硒含量，顯著增加果實可溶性固形物含量，改善果實品質。黃麗美等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，硒具有抗氧化及修復葉綠體的作用，能清除植物體內由重金屬脅迫產(chǎn)生的有害氧化性物質，調節(jié)機體維持體內氧化還原物質處于正常水平，保護膜結構和功能的完整性，提高植物抗逆性，達到緩解重金屬脅迫的目的；硒與金屬元素問具有很強的結合力，可降低砷、汞、鉛、鉻和鎘等重金屬元素對生物體的毒害?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關硒對重金屬脅迫的研究主要集中于小麥（李瑞平等，2011）、水稻（劉春梅等，2015）、油菜（彭玲等，2015）、玉米（黃麗美等，2017）和蔬菜（趙秀峰等，2017）等作物上，針對銅脅迫釀酒葡萄幼苗生理特I生影響的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】通過溫室盆栽試驗，探討外源硒對銅脅迫赤霞珠（Cabemet Sauvignon）葡萄幼苗葉片光合色素含量、抗氧化酶[過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）]活性、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白含量的影響，揭示適量硒對銅脅迫毒害葡萄幼苗的緩解作用，為生產(chǎn)中提高釀酒葡萄果實硒含量、改善其品質及緩解銅脅迫提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試葡萄品種為歐亞種釀酒葡萄赤霞珠1年生扦插苗，供試土壤為寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)淡灰鈣沙土。供試銅源硫酸銅（CuSO₄·5H₂0）、硒源亞硒酸鈉（Na₄SeO₃）購自成都化夏化學試劑有限公司。

1.2試驗方法

盆栽試驗于2016年5～12月在北方民族大學生物科學與工程學院日光溫室中進行。選取生長勢一致、具6～9片葉片的1年生赤霞珠葡萄扦插苗移栽于高30 cm、盆口直徑25 cm、盆底直徑13 cm的塑料花盆中，每盆盛干沙土10.5kg，施氮磷鉀復合肥20.0g，每盆移栽1株幼苗，充分灌水使土壤水含量基本一致。待緩苗生長3個月后，挑選生長一致的36盆幼苗進行試驗處理。依據(jù)《GB15618-1995土壤環(huán)境質量標準》設置銅和硒處理水平。試驗采用完全隨機區(qū)組設計，共4個處理，分別為：對照（CK，不施銅和硒）、1.0 mg/kg硒處理（硒處理）、300.0 mg/kg銅處理（銅處理）和1.0 mg/kg硒+300.0 mg/kg銅處理（硒+銅處理），每處理3次重復，每重復3株幼苗。銅和硒含量折算后配制成對應的溶液，硒或銅處理一次性將硒或銅溶液均勻噴人土壤，而硒+銅處理先一次性均勻噴入銅溶液，平衡24 h后再一次性噴人硒溶液；定期澆水，保持土壤水含量為15%～20%，30 d采集樣品進行相關指標測定。采樣時隨機選取幼苗頂部向下3節(jié)位內的葉片，每次每株采集1片，用自封袋密封后置于冰盒中保存，帶回實驗室用去離子水洗干凈，用吸水紙擦干，去除主葉脈，剪碎混勻后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3測定指標及方法

1.3.1抗氧化酶活性測定粗酶液提取：稱取0.5 g葉樣品放人研缽中，加5.0mL 0.05mol/L磷酸緩沖液（pH 7.8），冰浴研磨，勻漿倒入離心管中，冷凍離心20 min（10000r/min），取上清液（酶液）分裝于1.5mL離心管中，置于-20℃下保存待用。參照張志良等（2009）的方法，采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光化學還原反應法測定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性，采用紫外分光光度法測定CAT活性。

1.3.2 MDA和可溶性蛋白含量測定參照張志良等（2009）的方法，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，采用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白含量。

1.3.3葉片光合色素含量測定參照張志良等（2009）的方法，采用丙酮一乙醇法測定葉片光合色素含量，利用下列公式計算葉綠素（Chl）和類胡蘿卜素（Car）含量。

1.4統(tǒng)計分析

采用SAS 8.0對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，以LSD法進行多重比較，以Excel 2007制圖。

2結果與分析

2.1硒對銅脅迫釀酒葡萄幼苗葉片光合色素含量的影響

光化學反應中心是由葉綠體內的光合色素組成，其含量直接影響光合速率。從圖1可看出，硒處理能提高釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b、總葉綠素（Chl a+b）和Car.含量，分別比CK增加0.93%、13.5%、3.76%和6.35%，但差異不顯著（P>0.05，下同）；銅處理能顯著降低釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl a+b和Car.含量（P<0.05，下同），明顯降低Chl b含量；硒+銅處理下釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b和Chl a+b含量略高于CK，差異不顯著，但顯著高于銅處理，Car.含量低于CK，明顯高于銅處理。從圖1還可看出，各處理問的Chl a/b和（Chl a+b）/Car.均無顯著差異，但硒+銅處理的Chl a/b和（Chl a+b）/Car.略低于銅處理。說明土壤中施用1.0 mg/kg硒可提高葡萄幼苗對300.0 mg/kg銅脅迫的耐受力。

2.2硒對銅脅迫釀酒葡萄幼苗葉片MDA和可溶性蛋白含量的影響

從圖2-A可看出，硒處理可顯著降低葡萄葉片的MDA含量，銅處理可明顯提高葡萄葉片的MDA含量，但與CK差異不顯著；硒+銅處理葡萄葉片的MDA含量顯著低于CK和銅處理。從圖2-B可看出，硒處理葡萄葉片的可溶性蛋白含量略低于CK，二者差異不顯著；銅處理葡萄葉片的可溶性蛋白含量最低，顯著低于CK，但與硒處理和硒+銅處理差異不顯著。說明土壤中施用1.0 mg/kg硒能顯著降低300.0mg/kg銅脅迫葡萄幼苗葉片的MDA含量，明顯提高可溶性蛋白含量，從而降低銅對葡萄幼苗的細胞膜質過氧化作用，提高其保水能力，緩解逆境對其造成損傷。

2.3硒對銅脅迫釀酒葡萄幼苗抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是植物處于逆境時的重要保護機制，通過調控酶活性的變化，可緩解逆境對植物的損傷。從圖3-A和圖3-B可看出，硒處理葡萄幼苗葉片的SOD活性和比活力分別為239.6 U/mgFW和5.27 U/mg，均略低于CK。從圖3-C和圖3-D可看出，硒處理葡萄幼苗葉片的POD活性和比活力分別為223.5 U/mgFW和21.88 U/mg，均明顯高于CK。從圖3一E和圖3一F可看出，硒處理葡萄幼苗葉片的CAT活性和比活力分別為110.5 U/mgFW和10.46 U/mg，均顯著高于CK。從圖3還可看出，銅處理可顯著提高葡萄幼苗葉片的SOD、POD、CAT活性及比活力；硒+銅處理與銅處理問的SOD、POD、CAT活性及比活力均存在一定差異，但差異不顯著。說明硒元素對釀酒葡萄幼苗的保護作用可能主要通過非酶抗氧化物質而不是通過提高抗氧化酶活性完成。

2.4光合色素、MDA含量、抗氧化酶活性及比活力間的相關性分析結果

從表1可看出，硒對銅脅迫葡萄幼苗葉片的Chla+b含量與MDA含量呈顯著負相關，表明葉片的MDA含量越高，其Chl含量越低，MDA含量越低則Chl含量越高；Car.含量與SOD比活力也呈顯著負相關，表明葉片的Car.含量越高，其SOD比活力越低，Car.含量越低則SOD比活力越高；其他指標間均無顯著相關性。

3討論

王婭玲等（2016）研究認為，銅離子作為葉綠體質體藍素組成部分參與茶樹的光合作用，也是某些葉綠素合成酶的活化劑，高含量銅對茶樹有明顯的毒害作用，引起茶樹體內酶系統(tǒng)紊亂，葉綠素合成受阻。本研究結果與其相似，300.0 mg/kg銅脅迫會降低釀酒葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chl a+b和Car.含量，可能是因為葡萄幼苗吸收的銅離子與合成Chl相關酶肽鏈中富含巰基的部分結合，改變了酶的結構，抑制了Chl合成酶的活性，導致光合強度降低（葛淑芳等，2014），也可能是因為高濃度銅離子促使葉綠體酶體失活，葉綠體分解加快的結果（李永杰等，2010），與譚明明等（2014）對甜瓜的研究結果一致。王麗霞（2010）研究發(fā)現(xiàn)，硒是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的組分，也參與輔酶A和輔酶Q的合成，一定濃度（<0.1 mg/L）的硒可增強線粒體呼吸速率和葉綠體電子傳遞速率，超出閾值（≥1.0 mg/L）時則導致其速率降低。本研究結果表明，施用硒能提高葡萄幼苗的Chl含量，單一施人低濃度（1.0 mg/kg）硒可提高葡萄幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chla+b和Car.含量，而300.0 mg/kg銅脅迫下施入1.0 mg/kg硒可減小葡萄幼苗葉片Chl a、Chl b、Chla+b和Car.含量的下降幅度，且可降低Chl a/b和提高（Chl a+b）/Car，表明硒能提高葡萄幼苗對銅脅迫的耐受力，與胡斌等（2011）對小白菜的研究結果一致。

植物抗氧化酶系統(tǒng)活性的變化及膜脂過氧化作用能反映植物對逆境的響應，SOD、POD和CAT等組成的抗氧化系統(tǒng)是植物的重要保護機制，當植物遭受逆境脅迫時，植物體內SOD、CAT和POD活性迅速升高，可有效清除活性氧自由基，保護細胞免受活性氧的傷害。SOD是植物抗氧化的第一道防線，能將多余的超氧陰離子歧化為H₂O₂和O₂，隨后H₂