水解工藝對苦蕎提取物中槲皮素含量的影響及其藥代動(dòng)力學(xué)研究

鄭 瑾,卓虹伊,宋 雨,代麗萍,鄧園源,鄒 亮2,,陳慧娟

(1.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所,四川成都 610052;2.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川成都 610106;3.成都大學(xué)農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610106;4.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137;5.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106;6.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所,四川成都 610031)

苦蕎為蓼科蕎麥屬雙子葉植物苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn)的干燥成熟種子,又名韃靼蕎麥、萬年蕎。它是一種藥食同源雜糧,不僅含有蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等豐富的營養(yǎng)成分[1-3],還富含蘆丁、槲皮素(兩者互為苷和苷元,蘆丁在體內(nèi)外可轉(zhuǎn)化為槲皮素)等黃酮類生物活性成分,其中蘆丁含量最高,約占總黃酮的85%[4]。現(xiàn)代藥理研究表明蘆丁和槲皮素均具有降血糖、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等作用[5-6]。

由于其獨(dú)特的生物活性,近年來苦蕎新產(chǎn)品開發(fā)已成為苦蕎現(xiàn)代加工新型產(chǎn)業(yè),苦蕎掛面、茶飲、面點(diǎn)、酒、芽菜等多種形式的產(chǎn)品已走向市場。但其主要活性物質(zhì)蘆丁在腸道菌群作用下會(huì)轉(zhuǎn)化為槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素、蘆丁去羥基化產(chǎn)物以及甲基化產(chǎn)物等代謝產(chǎn)物[7]。在葡萄糖存在的情況下腸道細(xì)菌還可將蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷代謝為3,4-二羥基苯乙酸、蟻酸鹽、丁酸鹽等[8],這導(dǎo)致蘆丁在體內(nèi)難吸收,血藥濃度低,口服生物利用度差,難以較好的發(fā)揮生物活性,而槲皮素較蘆丁脂溶性強(qiáng)更易于跨膜吸收進(jìn)入血液循環(huán)更好的發(fā)揮生物活性。為了提高苦蕎加工產(chǎn)品中蘆丁和槲皮素在機(jī)體內(nèi)吸收的相對量,指導(dǎo)深加工工藝,本文采用藥代動(dòng)力學(xué)方法(藥物代謝動(dòng)力學(xué)簡稱藥動(dòng)學(xué),主要研究機(jī)體對藥物的處置的動(dòng)態(tài)變化。包括藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄的過程,特別是血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律)進(jìn)行深入研究。

藥動(dòng)學(xué)研究表明,自然界中多數(shù)糖苷類化合物是在腸道菌群作用下酶解為苷元發(fā)揮藥效,且機(jī)體對苷類化合物的吸收小于其苷元類化合物[9],如芍藥苷的生物利用度比其苷元低40倍[10]。同時(shí),由于胃的特殊酸性環(huán)境,其能快速吸收槲皮素而不能水解吸收其苷類成分蘆丁[11]。

故本研究通過前處理工藝,利用鹽酸對苦蕎提取物中的蘆丁進(jìn)行酸水解以提高槲皮素含量,即改變苦蕎提取物組成。再進(jìn)一步結(jié)合藥代動(dòng)力學(xué)方法,探討酸水解對苦蕎提取物中蘆丁和槲皮素進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)相對量的影響,為其他富含蘆丁的天然產(chǎn)物的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar雄性大鼠 30只、210±10 g、SPF級(jí),動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)2015-030,四川達(dá)碩生物科技有限公司;苦蕎籽 四川金堂西蕎1號(hào)種子;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)140225,純度≥98%)、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)150419,純度≥98%)、黃芩素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)160725,純度≥98%) 四川省維克奇生物科技有限公司;β-葡萄糖醛酸酶(SL-BG93V,90000 units/mL)、硫酸酯酶(SLBM7635V,10000 U/mL) 美國Sigma公司;乙醇、鹽酸、羧甲基纖維素鈉等 均為分析純;乙腈、甲醇、冰醋酸 色譜純;肝素化1.5 mL離心管(2 mg/mL肝素鈉溶液50 μL烘干) 實(shí)驗(yàn)室自制。

CPA225D型電子天平 德國賽多利斯公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;KH5200DE型數(shù)控超聲波機(jī) 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;WH-3型渦旋混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;高效液相色譜儀(LC-20AB型二元泵、SPD-20A型紫外檢測器、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦蕎提取物酸水解

1.2.1.1 苦蕎提取物及其供試品溶液的制備 稱取苦蕎籽適量,用60%乙醇85 ℃回流提取2次、每次2 h,過濾、合并濾液,80 ℃減壓干燥[12]即得苦蕎提取物。稱取苦蕎提取物10 mg于10 mL棕色容量瓶中,甲醇超聲溶解并定容至刻度,用0.22 μm濾膜過濾,即得,備用。

1.2.1.2 苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定色譜條件 色譜柱:Global Chromatography C18(250 mm×4.6 mm、5 μm);柱溫35 ℃、檢測波長275 nm、流動(dòng)相0.2%醋酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0.01～10 min,25% B;10～13 min,75% B;13～20 min,25% B)、流速1.0 mL/min、進(jìn)樣量20 μL。

1.2.1.3 苦蕎提取物酸水解 稱取苦蕎提取物1 g,置于圓底燒瓶,加入適量一定濃度的乙醇溶液25 mL(含VC2 mg/mL)超聲溶解,再加入濃鹽酸適量、混勻,并用該乙醇溶液補(bǔ)足反應(yīng)溶劑至30 mL。將圓底燒瓶置于水浴鍋中加熱回流,冷卻過濾,水洗濾餅至中性,70 ℃減壓干燥,避光保存。

1.2.1.4 單因素實(shí)驗(yàn) 參照“1.2.1.3”項(xiàng)下方法,酸水解條件為:固定反應(yīng)條件為乙醇百分含量90%、水解溫度50 ℃、水解時(shí)間2 h,考察不同的鹽酸百分含量(0.14%、0.28%、0.42%、0.56%、0.71%、0.83%、0.98%、1.12%)對槲皮素含量變化的影響;固定反應(yīng)條件為鹽酸百分含量0.83%、乙醇百分含量90%、水解溫度50 ℃,考察不同水解時(shí)間(0.5、1、1.5、2、4、6、8、10 h)對槲皮素含量變化的影響;固定反應(yīng)條件為鹽酸百分含量0.83%、水解溫度50 ℃、水解時(shí)間6 h,考察不同乙醇百分含量(40%、60%、80%、90%、100%)對槲皮素含量變化的影響;固定反應(yīng)條件為鹽酸百分含量0.83%、水解時(shí)間6 h、乙醇百分含量60%,考察不同水解溫度(30、50、70、90 ℃)對槲皮素含量變化的影響。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素變量對苦蕎提取物酸水解后槲皮素含量變化的影響。

1.2.1.5 苦蕎提取物酸水解正交實(shí)驗(yàn) 為優(yōu)化苦蕎提取物中蘆丁酸水解為槲皮素的工藝,以槲皮素的含量為指標(biāo)在單因素考察的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)見表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.1.6 苦蕎提取物酸水解樣品制備 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)最佳酸水解工藝,在苦蕎提取物酸水解過程中第1、2、4、6 h分別取樣,并醇沉去糖、取濾液回收乙醇,然后水沉蘆丁與槲皮素、冷卻過濾、水洗濾餅至中性,70 ℃減壓干燥。即得不同槲皮素含量的酸水解產(chǎn)物1、2、3、4,用于后續(xù)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 苦蕎提取物酸水解產(chǎn)物藥代動(dòng)力學(xué)

1.2.2.1 槲皮素儲(chǔ)備液、黃芩素內(nèi)標(biāo)液配制 精密稱取槲皮素對照品10.28 mg,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1028 μg/mL的槲皮素儲(chǔ)備溶液。精密稱取黃芩素對照品12.12 mg,配制成質(zhì)量濃度為1212 μg/mL的黃芩素儲(chǔ)備液,并稀釋成質(zhì)量濃度為80.8 μg/mL的黃芩素內(nèi)標(biāo)液。

1.2.2.2 給藥與樣本采集 30只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組、每組6只,分別為苦蕎提取物組、水解產(chǎn)物1、2、3、4組。實(shí)驗(yàn)前16 h大鼠禁食不禁水,灌胃給予苦蕎提取物及各水解產(chǎn)物200 mg/kg,分別于灌胃前及灌胃后5、10、20、30、60、120、240、360、480、720、960、1200、1440 min經(jīng)尾靜脈取血約0.3 mL置于1.5 mL肝素化的離心管中,室溫4000 r/min離心10 min,取上清液備用。

1.2.2.3 血漿樣品處理方法 參照文獻(xiàn)[13]血漿樣品處理方法,取血漿100 μL加入0.5 mol/L乙酸溶液(含VC2 mg/mL)20 μL,加入β-醛酸酶和硫酸酯酶混合溶液100 μL(含β-醛酸酶和硫酸酯酶各100 IU)混勻,37 ℃孵化30 min,再加入80.8 μg/mL的黃芩素內(nèi)標(biāo)溶液15 μL,混勻后加入乙酸乙酯1 mL、2000 r/min渦旋2 min、5000 r/min離心5 min,吸取上清液,37 ℃氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶、12000 r/min離心5 min,吸取上清液測定槲皮素和黃芩素的峰面積,并計(jì)算其比值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算槲皮素含量。

1.2.2.4 大鼠血漿槲皮素含量測定 色譜條件同“1.2.1.2 苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定色譜條件”。

1.2.2.5 方法學(xué) 專屬性考察：取槲皮素、黃芩素儲(chǔ)備液少許以及“1.2.2.2”項(xiàng)下的空白血漿及灌胃后含藥血漿,經(jīng)“1.2.2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理,按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。

線性關(guān)系考察:取槲皮素儲(chǔ)備溶液,并用甲醇逐級(jí)稀釋為質(zhì)量濃度為25.700、5.140、1.028、0.206、0.103、0.051、0.028 μg/mL的系列槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL,分別加入“1.2.2.2”項(xiàng)下空白血漿100 μL,經(jīng)“1.2.2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理,按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,并計(jì)算槲皮素與黃芩素峰面積的比值。

精密度與準(zhǔn)確度:制備低、中、高3個(gè)不同濃度的槲皮素對照品溶液100 μL、各5份,分別加入“1.2.2.2”項(xiàng)下空白血漿100 μL,經(jīng)“1.2.2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理制成濃度為0.066、12.850、24.015 μg/mL的質(zhì)控樣品,按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)測定3 d,每天1次,計(jì)算日間精密度;各質(zhì)控樣品的實(shí)測濃度與相應(yīng)質(zhì)量濃度槲皮素對照品溶液的比值即為準(zhǔn)確度。

提取回收率:制備上述低、中、高3個(gè)不同濃度質(zhì)控樣品,各5份,按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,與相應(yīng)質(zhì)量濃度槲皮素對照品溶液的峰面積進(jìn)行比較,計(jì)算回收率(%)。

穩(wěn)定性考察:制備上述低、中、高3個(gè)不同濃度的血漿樣品,分別在室溫條件下放置6 h、-20 ℃凍存7 d,冷凍凍融1次,經(jīng)“1.2.2.3”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理,以及上述低、中、高3個(gè)不同濃度的質(zhì)控樣品在4 ℃條件下放置24 h后,按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,測定血漿樣品中槲皮素的質(zhì)量濃度,考察其穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.0軟件進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算,并結(jié)合SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,比較各實(shí)驗(yàn)組的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)是否有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎提取物酸水解

2.1.1 苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定方法學(xué) 通過對苦蕎提取物中蘆丁、槲皮素含量測定的方法學(xué)考察,結(jié)果表明空白溶液無雜質(zhì)干擾,分離度和拖尾因子符合要求,理論塔板數(shù)以蘆丁計(jì)不少于4000。蘆丁與槲皮素的回歸方程分別為y=21635x+2191(r=1)、y=39015x-8258.5(r=1),結(jié)果表明蘆丁、槲皮素分別在0.093～291.2 μg/mL和0.167～259 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其精密度、重復(fù)性RSD均小于1.24%,在12 h內(nèi)兩者穩(wěn)定性良好。

2.1.2 單因素實(shí)驗(yàn) 由圖1可知，當(dāng)乙醇百分含量為60%和100%時(shí)，苦蕎提取物酸水解后槲皮素總量物顯著性差異，故擇優(yōu)選擇60%作為苦蕎提取物酸水解的溶媒。固定苦蕎提取物酸水解反應(yīng)的其他條件不變，以槲皮素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，苦蕎提取物酸水解單因素結(jié)果為鹽酸百分含量0.83%、水解時(shí)間6 h、乙醇百分含量60%、水解溫度70 ℃。說明苦蕎提取物酸水解需在適宜的酸性環(huán)境和適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)完成，這可能與苦蕎提取物中的蘆丁和槲皮素在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性有關(guān)。

圖1 單因素條件對苦蕎提取物酸水解后槲皮素含量的影響

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn) 苦蕎提取物酸水解正交實(shí)驗(yàn)的極差分析及方差分析結(jié)果如表2、表3所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

表3 方差分析表

由表2、表3可知,因素A、B、D對酸水解工藝具有顯著性影響,因素C對酸水解工藝無顯著性影響,其影響的主次因素依次是A>D>B>C。從節(jié)約成本的目的出發(fā),選擇50%乙醇作為溶媒,即最佳水解工藝條件為A3B2C1D2。在鹽酸百分含量為0.91%、水解時(shí)間6 h、50%乙醇、70 ℃條件下酸水解,工藝所需成本相對較低,水解后槲皮素濃度最高可達(dá)74.95 μg/mL。由于槲皮素在光照、酸性條件[14]下不穩(wěn)定,為盡可能保證苦蕎提取物經(jīng)酸水解后槲皮素含量最高,故酸水解應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)完成,避免槲皮素的生成速率低于其降解速率,導(dǎo)致提取物中槲皮素總量下降。

2.1.4 苦蕎提取物酸水解樣品 苦蕎提取物經(jīng)酸水解后,部分蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素。在水解過程中隨著水解時(shí)間延長,槲皮素含量逐漸增高,水解產(chǎn)物4中蘆丁轉(zhuǎn)化率可達(dá)64.11%。通過樣品采集所得的4份水解產(chǎn)物中蘆丁、槲皮素含量如表4。

表4 苦蕎提取物酸水解蘆丁、槲皮素含量變化及其摩爾比值

2.2 苦蕎提取物藥代動(dòng)力學(xué)

2.2.1 苦蕎提取物藥代動(dòng)力學(xué)方法學(xué)結(jié)果 專屬性結(jié)果如圖2所示,槲皮素保留時(shí)間為9.519 min,黃芩素保留時(shí)間為11.448 min,分離度良好,血漿內(nèi)源性雜質(zhì)無干擾。以槲皮素的血藥濃度為橫坐標(biāo),槲皮素峰面積與黃芩素內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得y=0.0185x+0.0042(R2=0.999),表明槲皮素在0.028～25.7 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。槲皮素的準(zhǔn)確度為93.46%～99.69%,日內(nèi)、日間精密度RSD值均不大于9.82%,符合生物樣本分析方法的要求。低、中、高三種濃度槲皮素的提取回收率分別為76.20%±4.25%、79.33%±2.86%、75.96%±2.60%,表明該方法的提取回收率良好。血漿樣品在室溫下放置6 h,-20 ℃凍存7 d,其RSD均小于9.36%,經(jīng)1個(gè)凍融周期后RSD均小于8.15%,處理后的分析物在4 ℃,存放24 h后其RSD均小于9.86%,表明生物樣本穩(wěn)定性良好。

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 苦蕎提取物酸水解樣品藥代動(dòng)力學(xué)研究

藥時(shí)曲線:大鼠分別灌胃苦蕎提取物及其酸水解產(chǎn)物后各時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品經(jīng)HPLC測定后,得出各實(shí)驗(yàn)組藥時(shí)曲線,見圖3。

圖3 大鼠體內(nèi)槲皮素的平均血藥濃度—時(shí)間曲線

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù):各實(shí)驗(yàn)組的槲皮素血藥濃度數(shù)據(jù)采用DAS 2.0進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算，并通過SPSS 19.0對其進(jìn)行方差分析得出各實(shí)驗(yàn)組與苦蕎提取物組的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異,見表5。

表5 大鼠灌胃苦蕎提取物后槲皮素的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

由圖3和表5可得,苦蕎提取物經(jīng)酸水解后,蘆丁含量逐漸降低,槲皮素含量逐漸增高,其酸水解產(chǎn)物較苦蕎提取物吸收速率加塊、累計(jì)吸收量增加。這是由于在水解過程中蘆丁去糖基轉(zhuǎn)化為槲皮素,其極性減小,脂溶性增加,槲皮素在機(jī)體內(nèi)更容易被小腸絨毛吸收、穿過腸壁、進(jìn)入血液,從而更易于吸收進(jìn)入體循環(huán)。

蘆丁與槲皮素不僅脂溶性有差異,其在體內(nèi)的代謝途徑亦有所不同。蘆丁在體內(nèi)主要為酯水解的Ⅰ相代謝,其在體內(nèi)黃酮醇母核裂解和糖苷鍵斷裂兩種方式同時(shí)進(jìn)行[15],減少了機(jī)體對蘆丁的吸收和利用。而槲皮素在體內(nèi)為硫酸化和葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代謝,槲皮素經(jīng)Ⅱ相代謝后會(huì)生成槲皮素葡萄糖苷,經(jīng)膽汁排出進(jìn)入腸道,在腸道內(nèi)槲皮素葡萄糖苷能夠被腸道菌群完全代謝為槲皮素或其他物質(zhì)而被腸道重吸收[7],即槲皮素的腸肝循環(huán)。而且腸道內(nèi)的糖苷水解酶只能作用于單分子葡萄糖苷,對雙糖苷無活性[16],故槲皮素葡萄糖苷在腸道內(nèi)比蘆丁更易吸收[17]。

此外,腸道菌群個(gè)體差異也會(huì)導(dǎo)致苦蕎提取物中蘆丁在人體內(nèi)的吸收差異。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展,抗生素濫用造成機(jī)體腸道菌群紊亂,由腸道菌群產(chǎn)生的糖苷水解酶不能正常分泌,以致人體不能有效吸收苦蕎提取物中的蘆丁而發(fā)揮生物活性。通過酸水解直接將苦蕎提取物中的蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素,不僅避免了腸道菌群差異帶來的吸收差異性,而且還有利于提高苦蕎提取物中蘆丁和槲皮素的累計(jì)吸收量。

3 結(jié)論

以鹽酸百分含量0.91%、水解時(shí)間6 h、乙醇百分含量50%、水解溫度70 ℃為工藝條件對苦蕎提取物進(jìn)行酸水解,苦蕎提取物中的蘆丁可最大程度的轉(zhuǎn)化為槲皮素。藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明,苦蕎提取物經(jīng)酸水解后其進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮生物活性的苷元槲皮素增多,達(dá)峰時(shí)間縮短、峰濃度增加。這不僅可改善苦蕎提取物中蘆丁吸收差和吸收慢的現(xiàn)象,而且對于指導(dǎo)苦蕎的提取、深加工,開發(fā)高利用率苦蕎產(chǎn)品具有重要意義,同時(shí)對于其他類似苷和苷元的產(chǎn)品開發(fā)具有借鑒作用。

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