海參皂苷Echinoside A的酶解及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定與溶血毒性

陳靜蘭,宋珊珊,孫樹紅,李學敏,劉炎俊,李兆杰,*,王玉明,薛長湖

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003;2.青島市中心醫(yī)院,山東青島 266042)

皂苷廣泛存在于動植物中,是天然防御活性物質(zhì)。其中,海參皂苷的分子結(jié)構(gòu)已有700多種被闡明[1-4]。海參皂苷主要是為羊毛甾烷型三萜皂苷,絕大部分屬于海參烷[4-5],其寡糖鏈一般含有2～6個單糖基,一般為喹諾糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、3-O-甲氧基葡萄糖及3-O-甲基木糖等單糖。其中海參皂苷Echinoside A(結(jié)構(gòu)如圖1),糖鏈序列Xyl-(-Sul)-β-(1-2)-Qui-β-(1-4)-Glu-β-(1-3)-MeGlu,[M-H]-m/z=1183.5[5-10,14]。海參皂苷具有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤,細胞毒性等生理活性[11-13],但是由于其溶血毒性過強,極大地限制了其在食品及醫(yī)藥中的應(yīng)用。因此研究降低海參皂苷溶血毒性具有重要現(xiàn)實意義。

圖1 Echinoside A(EA)化學結(jié)構(gòu)

目前降低皂苷溶血毒性的方法主要有化學降解法、酶降解法及微生物降解法。利用化學制備高生理活性的次級苷,仍然是目前主要方法。國內(nèi)已有人利用醋酸和濃硫酸等酸法水解人參皂苷,制備出多種高活性次級人參皂苷,同時也有利用三氟乙酸和硫酸對海參皂苷Echinoside A進行水解制備一列的次級海參皂苷及苷元,但是酸法專一性差,反應(yīng)條件劇烈，不易控制,極易破壞皂苷苷元結(jié)構(gòu),產(chǎn)物混雜,導致目標產(chǎn)物分離困難[15-16]。皂苷分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵在堿水溶液中降解較難進行,因此通常需要提高反應(yīng)溫度等加以實驗[17]。而酶解法具有反應(yīng)條件溫和、專一性高、產(chǎn)率高、產(chǎn)物單一等特點。人參皂苷如Rb1、Rh2、Rg3等與河參皂苷結(jié)構(gòu)類似，都屬于三萜皂苷。國內(nèi)外已有多人利用微生物菌體或利用微生物制備人參皂苷酶來將人參皂苷酶解成稀有人參皂苷C-K、C-Mx等[18-20],但是微生物降解法中微生物篩選及培養(yǎng)非常困難,成本較高,產(chǎn)物較復雜，不利于單體分離制備。目前,已有利用商品糖苷酶制備高活性的人參皂苷[21],但利用商品糖苷酶進行酶解未見報道。并且利用商品酶進行制備低溶血毒性的次級海參皂苷,比較經(jīng)濟實惠,同時有利于工業(yè)化利用。

本文選用5種商品糖苷酶對海參皂苷Echinoside A進行酶解,篩選出有酶解效果的商品糖苷酶,并分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu),確定酶解產(chǎn)物,從而制備出次級海參皂苷,其溶血毒性明顯降低,有利于海參皂苷作為藥劑型商品開發(fā)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菲律賓刺參(Pearsonothuria graeffei) 青島南山市場;乙腈(色譜純)、碳酸氫銨(色譜純) 美國Sigma Aldrich公司;二甲基亞砜(DMSO) 國藥集團化學試劑有限公司;健康小白鼠(15～20 g,雌鼠,2只) 山東魯抗制藥有限公司;5種商品糖苷酶 見表5。

Aglient 1100型高效液相色譜儀、G6410型三重四級桿質(zhì)譜儀 美國Aglient公司。

表1 5種商品糖苷酶

1.2 實驗方法

1.2.1 EA的制備 稱取菲律賓刺參1 kg在80 ℃烘箱烘干,然后粉碎成粉末,過200目篩;用60%乙醇在常溫條件下浸泡3 d,取上清液,浸泡三次,將上清液減壓濃縮,60 ℃水浴蒸干;經(jīng)水飽和正丁醇萃取,大孔樹脂柱層析除雜富集,正相硅膠析純化得到的總皂苷,最后反相硅膠柱層析分離得到海參皂苷EA[22]。EA的純度(%)=EA色譜圖峰面積/總峰面積×100

1.2.2 商品糖苷酶篩選及酶解產(chǎn)物分離純化 商品糖苷酶在pH5.0、40 ℃及100 U酶活力條件[21]下,酶解海參皂苷EA,每反應(yīng)12 h取樣一次,取5次樣。反應(yīng)60 h,利用TLC、HPLC以及質(zhì)譜檢測酶解產(chǎn)物。篩選出對海參皂苷EA有酶解效果的商品糖苷酶,并在此條件下酶解制備次級海參皂苷,利用制備液相分離純化得次級海參皂苷單體。

1.2.3 TLC檢測條件 展開劑:氯仿/甲醇/水(70∶30∶3,V/V/V),顯色劑:10%硫酸乙醇。

1.2.4 HPLC-MS、ESI-MS/MS檢測條件及制備液相條件 HPLC:流動相A相為乙腈,B相為0.1% NH4HCO3溶液,A相梯度隨著時間變化而變化:0～5 min,30%～30%;5～30 min,30%～60%;30～35 min,60%～30%;Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫30 ℃;流速:1 mL/min;檢測波長:205 nm。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,負離子模式;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度300 ℃;干燥氣溫度350 ℃;霧化氣(N2)流速10 L/min;壓力276 kPa;質(zhì)量掃描范圍:m/z 100～2000。

ESI-MS/MS:質(zhì)量掃描范圍:m/z 100～1000;碰撞誘導解離(CID)能量:80 eV;碰撞氣為高純氮氣。

制備液相:流動相:60%乙腈;流速:2 mL/min;色譜柱:AA12S05-2510WT ODS C18;柱溫:30 ℃;檢測波長:205 nm。

1.2.5 紅細胞混懸液的制備 小白鼠麻醉后取腹腔主動脈血,取血紅細胞,4 ℃保存;用時配制成2%的紅細胞(將兩只小鼠紅細胞混合)懸濁液。

1.2.6 受試樣品的配制 分別稱取4 mg海參皂苷EA及其次級皂苷,并分別溶解于1 mL DMSO配制成儲備液。用時利用生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液:0、1、1.5、2、3、5、10、20、40 μg/mL。

1.2.7 受試樣品溶血當量的測定 精確吸取各樣品0.5 mL,取0.5 mL蒸餾水作為陽性對照管,取0.5 mL生理鹽水作為陰性對照管,每管設(shè)3個平行管。在上述各管中加入0.5 mL的2%紅細胞懸濁液,混勻,37 ℃水浴保溫2 h,取出立即冰浴終止反應(yīng),離心(3000 r/min,5 min),取上清液,570 nm波長處測其吸光度,并計算溶血率。溶血率計算公式:溶血率(%)=(A樣- A陰)/(A陽- A陰)×100。以樣品的溶血率對樣品濃度作圖得到各樣品溶血曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 18.0軟件進行相應(yīng)數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EA的制備

按1.2.1的制備方法制得海參皂苷EA,并利用HPLC檢測,得到出峰時間為15.7 min,根據(jù)DAD色譜圖峰面積計算,EA純度為93.2%(如圖2),可以用于后續(xù)實驗。

圖2 EA的HPLC色譜圖

2.2 商品糖苷酶篩選結(jié)果及產(chǎn)物制備

取60 h后的酶解液進行TLC檢測,結(jié)果如圖3。由圖可知,1、2、3號酶對海參皂苷EA有明顯的酶解效果,4、5號酶對樣品進行酶解后,TLC圖中未發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)物。2、3號酶的TLC圖中分別出現(xiàn)一條生成物檢測條帶,且Rf值皆為0.24,推測為同一種產(chǎn)物;而1號酶的TLC圖中出現(xiàn)兩條生成物檢測條帶,其中一種產(chǎn)物檢測條帶和2、3號酶的酶解產(chǎn)物的Rf值相同,推測與2、3號酶的酶解產(chǎn)物相同,另一種產(chǎn)物的Rf值為0.53較大,說明其極性相對于前一種產(chǎn)物更小,推測可能是其被水解掉的糖基較多所致。

圖3 酶解產(chǎn)物的TLC分析圖

利用制備液相分離純化酶解產(chǎn)物化合物1、化合物2、化合物3和化合物4,白色晶體狀,不溶于水。

2.3 酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定

利用靈敏的HPLC-MS檢測技術(shù),對1、2、3號酶的酶解產(chǎn)物進行液質(zhì)檢測,得到其總離子流圖(Total Ion Chromatogram,TIC),如圖4(峰1為底物EA)。由圖可知1號酶水解EA生成兩種產(chǎn)物化合物1(峰2)和化合物2(峰3),其m/z分別為845.3[M-H]-和699.3[M-H]-,而2、3號酶分別得化合物3(峰4)和化合物4(峰5),其荷比均為m/z 845.3[M-H]-。由于化合物1,化合物3,化合物4具有相同的保留時間與質(zhì)荷比,推測可能為相同物質(zhì)。

圖4 TIC圖和MS圖

根據(jù)分子質(zhì)量計算,推測1、2、3號酶對海參皂苷EA糖鏈中喹諾糖與葡萄糖之間的β-(1-4)糖苷鍵進行了水解(如圖5),使皂苷EA脫去兩個單糖基MeGlc(176)和Glc(162),因此產(chǎn)物化合物1、化合物3和化合物4應(yīng)是相同物質(zhì);1號酶同時對皂苷EA糖鏈中木糖與喹諾糖之間的β-(1-2)糖苷鍵進行了水解,使皂苷EA脫去3個單糖基Qui(146)、MeGlc(176)和Glc(162),生成產(chǎn)物化合物2。

圖5 商品糖苷酶水解EA的分子裂解模式圖

為了進一步證明酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu),進行ESI-MS/MS檢測。在負離子模式下,對酶解產(chǎn)物化合物1(m/z 845[M-H]-)和化合物2(m/z 699[M-H]-)母離子進行裂解后,生成形成m/z 827、m/z 615和m/z 681、m/z 469的碎片離子(如圖8)。由于海參皂苷EA含有硫酸酯基的存在,其糖鏈沒有發(fā)生斷裂,而是先失去1個水分H2O(18 Da)形成m/z 1165[M-H]-的碎片離子,之后苷元上發(fā)生一系列的化學鍵斷裂,形成了含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碎片離子,其m/z 953[M-H]-[23](如圖6,圖7)。根據(jù)計算得,兩種酶解產(chǎn)物的母離子m/z 845[M-H]-和m/z 699[M-H]-先失去一個水分子H2O(18 Da)后形成m/z 827[M-H]-和m/z 681[M-H]-的碎片離子,然后苷元上發(fā)生一系列的化學鍵斷裂,形成了含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的碎片離子,m/z 615和m/z 469,其碎裂方式與海參皂苷EA碎裂方式相同,說明化合物1,2的苷元部分沒有發(fā)生改變,僅有糖鏈發(fā)生斷裂。由二級質(zhì)譜檢測化合物3和化合物4的斷裂方式與化合物1相同(如圖9)。由此可確定化合物1、化合物3和化合物4是同一種物質(zhì),是二糖基次級海參皂苷,化合物2是一糖基次級海參皂苷。

圖6 Echinoside A在負離子模式下的二級質(zhì)譜圖

圖7 Echinoside A負離子模式下的裂解模式圖

圖8 酶解產(chǎn)物在負離子模式下的ESI-MS/MS圖

圖9 化合物3、4在負離子模式下的ESI-MS/MS圖

目前,利用化學方法來制備海參次級皂苷,但其苷元和糖鏈上的官能團都會遭到不同程度破壞,如宋偉等[16]利用稀硫酸水解海參皂苷EA得到10種產(chǎn)物,所有產(chǎn)物都失去了硫酸酯基,其中生成苷元、單糖苷、二糖苷、三糖苷和四糖苷五類次級海參皂苷,然而每一類次級海參皂苷依據(jù)苷元結(jié)構(gòu)又分兩種海參次級苷—三醇型和二醇型;三氟乙酸水解產(chǎn)物單一,僅生成一個二醇苷元,但苷元上發(fā)生了脫水和雙鍵轉(zhuǎn)移。由于酶具有專一性,不同性質(zhì)的酶作用于不同構(gòu)型、不同組成的糖苷鍵,從而達到定向水解的目的。并且商品糖苷酶介導的生物轉(zhuǎn)化法條件相對溫和、選擇性高、轉(zhuǎn)化率高、副產(chǎn)物少、污染少[21]。相較于化學法水解,酶反應(yīng)條件溫和,專一性強,較好的保護了苷元和硫酸酯基的結(jié)構(gòu)完整,產(chǎn)物單一,宜于產(chǎn)物純化分離。另外，利用商品酶進行制備低溶血毒性的次級海參皂苷,比較經(jīng)濟實惠,且有利于工業(yè)化制備。

2.5 溶血實驗結(jié)果

2.5.1 溶劑的溶血作用 DMSO是對血紅細胞相對溫和的有機試劑,由表2可以看出當DMSO高達5%和10%濃度時,其溶血率卻僅有0.9%、1.87%,肉眼可以直接觀察到離心后的兩者上清液均無紅色現(xiàn)象,這說明DMSO溶血毒性濃度在低于5%時,溶劑DMSO對溶血影響非常小。

表2 DMSO溶血率

2.5.2 海參皂苷EA及酶解產(chǎn)物的溶血作用 由圖10可知,海參皂苷EA及酶解產(chǎn)物均具有溶血作用。在0～5 μg/mL濃度范圍內(nèi),EA的溶血率增長極快,且在小于5 μg/mL時其溶血率已達到60%;當溶度在5～20μg/mL范圍內(nèi),其溶血率緩慢增加到100%;在濃度20～40μg/mL范圍內(nèi),其溶血率基本保持不變。而化合物1在0～5 μg/mL濃度范圍內(nèi)溶血率增速明顯放緩,而且在5～40 μg/mL濃度范圍內(nèi)溶血率保持在60%左右,相對于EA的溶血率有明顯下降?；衔?的溶血率在0～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)小于10%,當濃度達40 μg/mL(僅含DMSO1%,可以忽略其對溶血的影響)時溶血率也小于30%。在相同濃度時,其溶血率:化合物2<化合物1<海參皂苷EA。由此說明海參皂苷的溶血率與皂苷糖鏈和皂苷濃度有密切關(guān)系,其中皂苷糖鏈愈短溶血率愈低;在較低濃度范圍內(nèi),海參皂苷EA和化合物1的溶血率增長較快,而化合物2在濃度較大時,溶血率才有明顯增長。

圖10 海參皂苷EA及酶解產(chǎn)物的溶血率曲線圖

海參皂苷溶血毒性與其皂苷結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系,尤其是對其糖鏈的修飾,但是目前主要利用化學水解法降低皂苷的溶血毒性,而化學法都對苷元和糖鏈上的官能團有嚴重破壞作用,并未詳細闡明硫酸酯基以及保持完整苷元結(jié)構(gòu)的次級海參皂苷與其溶血毒性的關(guān)系。本文有效地保護了硫酸酯基以及苷元上的其他官能團,進一步證明了海參皂苷的溶血率與糖鏈有密切關(guān)系,糖鏈愈短其溶血率愈低,為研究次級海參皂苷化合物的抗腫瘤、抗衰老等其他生理活性,以及硫酸基團對其生理活性的影響研究提供基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本文從五種商品糖苷酶篩選出三種對海參皂苷EA有專一性酶解作用的商品糖苷酶有果膠酶、果膠酶Ultra SP-L和纖維素酶。其中果膠酶Ultra SP-L和纖維素酶只斷裂寡糖鏈喹諾糖和葡萄糖之間的β-(1-4)糖苷鍵得到二糖基次級海參皂苷化合物1,即EA→化合物1。果膠酶主要斷裂糖鏈喹諾糖與葡萄糖之間的β-(1-4)糖苷鍵,同時將木糖與喹諾糖之間的β-(1-2)糖苷鍵斷裂得到一糖基次級海參皂苷化合物2,即EA→化合物1,EA→化合物2。海參皂苷的溶血率與糖鏈有密切關(guān)系,糖鏈愈短其溶血率愈低。

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