草魚乙酰輔酶A羧化酶β基因全長cDNA分子克隆與表達分析

嚴 媛 程漢良 許建和 韓 振 易樂飛 申 欣 丁祝進

(淮海工學院，海洋生命與水產(chǎn)學院，連云港 222005)

乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)是脂肪酸合成的限速酶，它以生物素為輔酶，催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A(malonyl CoA,MA)，為脂肪酸的合成提供底物[1-2]。原核生物ACC由3個基因編碼的亞基組成，它們分別是生物素羧化酶(biotin carboxylase,BC)、生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)和羧基轉(zhuǎn)移酶(Carboxyltransferase,CT)，真核生物ACC由1個基因編碼，并同時具有上述3個結(jié)構(gòu)域[3]。目前ACC有2種亞型，即ACC1(或ACCα)和ACC2(或ACCβ)，分別由ACACA和ACACB基因編碼。ACC2種亞型的組織分布不同，ACC1主要在脂肪生成活躍的組織如肝臟、脂肪和乳腺中表達，為脂肪酸合成提供原料，而ACC2主要在脂肪分解活躍的組織如肌肉和心臟中表達，通過調(diào)節(jié)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(carnitine palmitoyltransferase-Ⅰ,CPT-Ⅰ)發(fā)揮生物學功能[4]。在恒溫動物中，已經(jīng)克隆出鼠[5]、牛[6]等ACC1基因和人[7]ACC2基因的全長cDNA，人的ACC2基因含1個長度為7 449 bp的開放閱讀框，編碼2 483個氨基酸，定位在染色體12q23上[7]。ACC2與ACC1的氨基酸序列的相似性高達75%，兩者的主要區(qū)別在N端，哺乳動物的ACC2比ACC1多約140個氨基酸[8-9]，多出區(qū)域主要作用是將ACC2定位在線粒體外膜上。關(guān)于魚類ACC基因的研究較少，目前已經(jīng)克隆出草魚(Ctenopharyngodonidella)ACC1基因全長cDNA序列[10]。

草魚屬鯉形目鯉科，因其生長迅速、肉味鮮美、飼料來源廣和經(jīng)濟效益好而成為我國優(yōu)良養(yǎng)殖魚類。由于規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷擴大，魚類出現(xiàn)肝脂質(zhì)過度蓄積，所引起的代謝紊亂等問題也日趨嚴重。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，從分子層面上探究營養(yǎng)調(diào)控的機理是營養(yǎng)學研究的新趨勢。本試驗擬克隆草魚ACC2基因全長cDNA序列，分析其在不同組織中表達情況，研究飼喂不同脂肪源飼料后草魚肌肉和肝胰臟中及饑餓再投喂后草魚肝胰臟中ACC2 mRNA的表達變化，探討該基因在草魚脂肪代謝調(diào)控中的作用，為優(yōu)化草魚飼料配方提供參考，同時為解決養(yǎng)殖魚類營養(yǎng)性脂肪肝等問題提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 草魚ACC2基因全長cDNA分子克隆

1.1.1 試驗用魚

試驗用魚購自連云港市贛榆區(qū)歡墩漁場，規(guī)格為(56.4±1.8) g/尾。

1.1.2 試驗引物

本試驗所用引物見表1。本試驗共設計了3對ACC2實時熒光定量PCR引物，候選內(nèi)參基因β-肌動蛋白(ACTB)、eEF1A、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)1、GAPDH2、RPL13A和TUBB2分別設計2對引物，篩選擴增效率在0.90～1.05的引物為最終定量引物。

表1 試驗所用引物序列及預期產(chǎn)物大小

續(xù)表1引物名稱Primernames序列5'—3'Sequence(5'—3')用途Use預期產(chǎn)物大小Expectedproductsize/bpAC-F1GGAGCGTAAAGACTTGGAG與AP合用3'RACE第1輪—AC-F2GTTTGCGGCGACTGCTGTT與Race3-R合用3'RACE巢式PCR554AC-RTCGCTAGTCCCTCGTCCACATC5'RACE反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈—AC-R1TCATCTCAACATTGGCATAG與Oligo(dT)16AP合用5'RACE第1輪596AC-R2CGGAACATTTCATACGACCAG與AP合用5'RACE巢式PCR實時熒光定量PCR引物RT-qPCRprimersqACC2-F3qACC2-R3TCTACTTGGGTGCTGCTCGTGATGAGGTCAGAATGGCGACC2實時熒光定量PCR92qeEF1A-F3qeEF1A-R3CGCCAGTGTTGCCTTCGTCGCTCAATCTTCCATCCCTT內(nèi)參基因eEF1A實時熒光定量PCR98qACTB-F3qACTB-R3GATGATGAAATTGCCGCACTGACCGACCATGACGCCCTGATGT內(nèi)參基因ACTB實時熒光定量PCR135qGAPDH1-F1qGAPDH1-R1CCAAGTGTCAGGACGAACAGAGGTGCGACCGAATCCGTTGATACC內(nèi)參基因GAPDH實時熒光定量PCR—qGAPDH2-F2qGAPDH2-R2CAAGGCTGTGGGCAAAGTCATTCCGAGGCGGCAGGTGAGGTCAAC內(nèi)參基因GAPDH實時熒光定量PCR105qRPL13A-FqRPL13A-RCTTCTGGAGGACAGTAAGAGGTATGCGGAGGAGGGATGCCATCAAAGAC內(nèi)參基因RPL13A實時熒光定量PCR—

1.1.3 總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

取6尾喂食后6 h的草魚活體解剖，快速分離肝胰臟、脾臟、腎臟、前腸、中腸、后腸、腸系膜脂肪、大腦、白肌和心臟，液氮研磨，采用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒(RNeasy Lipid Tissue Mini Kit)按推薦的方法提取各個組織的總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，核酸蛋白定量儀測定RNA的濃度。采用QIAGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以Oligo(dT)16AP為引物，按推薦的方法去除DNA污染并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.1.4ACC2基因cDNA的克隆

根據(jù)斑馬魚(Daniorerio)(XM_009301377)和草魚已擴增序列，設計4對簡并引物和4對特異性引物，PCR擴增ACC2基因8段核心序列，25 μL反應體系如下：TaKaRa公司的Sapphire Amp Fast PCR Master Mix 12.5 μL，肝胰臟和心臟2種組織混合cDNA第1鏈1 μL，上、下游引物各0.5 μL，雙蒸水(ddH2O)10.5 μL。擴增條件為：94 ℃變性40 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，反應前95 ℃預變性3 min，反應后72 ℃充分延伸7 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，克隆測序。

1.1.5 草魚ACC2基因3′和5′cDNA末端快速擴增(RACE)

根據(jù)ACC2基因核心序列設計3′和5′RACE特異性引物(表1)。按照Cheng等[10]的方法克隆3′和5′末端序列。

1.1.6 序列分析

用DNAstar 7.1軟件包中SeqMan軟件將核心序列及3′和5′末端序列進行組裝，得到ACC2基因全長cDNA序列。用EditSeq對序列進行編輯和分析，尋找開放閱讀框，并翻譯成氨基酸序列。通過http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/預測信號肽，通過http://smart.embl-heidelberg.de/分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。

1.2 草魚ACC2基因組織表達

試驗用魚購自連云港市贛榆區(qū)歡墩漁場，規(guī)格為(56.4±1.8) g/尾。取6尾草魚活體解剖，快速分離肝胰臟、脾臟、腎臟、前腸、中腸、后腸、腸系膜脂肪、大腦、白肌和心臟，液氮研磨，提取各個組織的總RNA，以隨機引物按推薦的方法去除DNA污染并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，采用SYBR Green RT-qPCR方法，反應在Step One Plus PCR儀(ABI)上進行。采用QIAGEN的QuantiNova SYBR Green PCR Kit定量試劑盒，每個樣品設置3個重復，候選內(nèi)參基因分別為ACTB、eEF1A、GAPDH1、GAPDH2、RPL13A和TUBB2，利用軟件GenEx 6.0.1中g(shù)eNorm算法篩選內(nèi)參基因，對草魚ACC2基因組織表達進行定量分析。

1.3 不同脂肪源的飼料對草魚ACC2基因表達的影響

1.3.1 試驗飼料

試驗共設3組，3組飼料的脂肪源分別為5%魚油(魚油組)、5%豬油(豬油組)和5%豆油(豆油組)，飼料中其他組分完全相同(表2)。制作飼料的魚粉、魚油和預混料等主要原料由岳泰集團提供。稱量各種原料，充分混勻10 min，每千克原料加水500 mL，揉拌15 min，利用便攜式絞肉機進行制粒，放入干燥箱內(nèi)55 ℃烘3 h，室溫放置1 h，裝袋密封保存，編號，待用。

1.3.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在單循環(huán)可控試驗生態(tài)水槽系統(tǒng)的9個水缸內(nèi)完成，每個水缸體積240 L。試驗用魚購自連云港市贛榆區(qū)歡墩漁場，共180尾，規(guī)格為(56.4±1.8) g/尾，隨機分為3組，每組3個重復，每個水缸20尾，養(yǎng)殖周期12周，養(yǎng)殖水溫25～28 ℃。放養(yǎng)后用商品飼料喂養(yǎng)1周，馴化草魚上浮搶食，然后逐步換用試驗飼料。試驗期間，每天08:00、11:00、14:00和17:00各投飼1次，初期根據(jù)試驗魚的初始體重，按2%的日投餌率確定日投餌量為25 g/缸，如當日各缸飼料有剩余，稱重扣除，根據(jù)各缸草魚的吃食情況及時調(diào)整投餌量，每天草魚的采食量和采食情況及時記錄，后期日投餌量增加到35 g/缸。

表2 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1)預混料為每千克飼料提供The premix provided the following per kg of diets:VA 5 000 IU,VD 2 000 IU,VK 5 mg,VE 50 mg,VB18 mg,VB210 mg,VB120.03 mg,VB68 mg,泛酸 pantothenic acid 30 mg,煙酸 nicotinic acid 30 mg,葉酸 folic acid 3 mg,生物素 biotin 0.4 mg,VC 180 mg,肌醇 inositol 100 mg,Mg 300 mg,Cu 4 mg，F(xiàn)e 170 mg,Zn 150 mg,Mn 22 mg,I 1 mg,Co 0.25 mg,Se 0.4 mg。

2)計算值Calculated values。

1.3.3 不同脂肪源飼料對草魚ACC2基因表達的影響

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，統(tǒng)計各組剩余魚尾數(shù)，逐尾稱重。每缸取3尾，每個組共取9尾解剖，取內(nèi)臟稱重，計算臟體比，取肝胰臟和肌肉提取總RNA，用于ACC2基因表達定量研究。

1.3.4 饑餓再投喂對草魚ACC2基因表達的影響

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，禁食24 h后再次投喂，分別在投喂后3、6、12和24 h時每缸取3尾，每個組共取9尾解剖，取肝胰臟，用于總RNA提取和ACC2基因表達定量研究。

1.3.5 相關(guān)指標計算公式

增重率(%)=100×(試驗末魚體均重-
試驗初魚體均重)/試驗初魚體均重； 飼料系數(shù)=每個缸投喂飼料總量/
每個缸魚體總增重量； 臟體比(%)=100×試驗末魚體
內(nèi)臟重/試驗末魚體重。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件GenEx 6.0.1中g(shù)eNorm算法，篩選內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算ACC2基因的相對表達量，結(jié)果采用平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均通過了正態(tài)性和方差齊性檢驗，因此，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間多重比較采用最小顯著差數(shù)(LSD)檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚ACC2基因全長cDNA分子特征

草魚ACC2基因cDNA全長7 533 bp，含1個7 149 bp的開放閱讀框，編碼2 382個氨基酸，ACC2蛋白計算分子質(zhì)量為268.34 ku，等電點為6.13，命名為ACCβ-1(GenBank登錄號：MF611923)。此外，由于可變剪接，還發(fā)現(xiàn)另外1個分子質(zhì)量為267.53 ku的草魚ACC2蛋白的同工型(isoforms)，命名為ACCβ-2(GenBank登錄號：MF611924)，比ACCβ-1少8個氨基酸。

2.2 草魚ACC2基因的組織表達

經(jīng)篩選，以RPL13A和eEF1A基因組合為內(nèi)參基因，采用RT-qPCR方法對草魚ACC2基因在肝胰臟、脾臟、腎臟、前腸、中腸、后腸、腸系膜脂肪、大腦、白肌和心臟等組織中的表達進行了研究。結(jié)果表明，ACC2基因在所有檢測組織中均有表達，ACC2 mRNA的相對表達量在肌肉中最高，為29.13；在大腦、前腸和心臟中次之，分別為19.45、15.33和14.40；在肝胰臟中最低，僅為1.90。肌肉中ACC2 mRNA的相對表達量與大腦、前腸和心臟差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于其他組織(P<0.05，圖1)

數(shù)據(jù)柱上標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1ACC2基因在草魚不同組織中的表達分析

Fig.1 Expression analysis ofACC2 gene in different tissues of grass carp

2.3 不同脂肪源飼料對草魚生長指標的影響

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后對草魚的生長情況進行測量，計算增重率、飼料系數(shù)和臟體比等生長指標。由表3可以看出，魚油組和豆油組增重率分別為139.6%和138.8%，顯著高于豬油組(P<0.05)，豬油組的增重率只有128.8%，說明魚油和豆油是草魚良好的脂肪源，豬油效果較差；魚油組和豆油組的飼料系數(shù)分別為1.14和1.17，顯著低于豬油組(P<0.05)，表明豬油不適合單獨作為草魚的脂肪源。

2.4 不同脂肪源飼料和饑餓再投喂對草魚ACC2基因表達的影響

將6個內(nèi)參基因分別和不同脂肪源飼料組以及饑餓再投喂后ACC2的Ct值和擴增效率輸入軟件，最后軟件自動篩選，RPL13A和GAPDH2為不同脂肪源肝胰臟及肌肉中目的基因表達的內(nèi)參基因，ACTB和GAPDH1為饑餓再投喂目的基因表達的內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，投喂不同脂肪源飼料對草魚肝胰臟及肌肉中ACC2 mRNA的相對表達量均無顯著影響(P>0.05，圖2)；饑餓再投喂后，草魚肝胰臟中ACC2 mRNA的相對表達量在投喂后12 h時顯著升高(P<0.05)，且達到高峰值6.17，之后出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，24 h時僅為2.84(圖3)。

表3 不同脂肪源飼料對草魚生長指標的影響

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same column, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖2 投喂不同脂肪源飼料的草魚肝胰臟和

3 討 論

3.1 草魚ACC2蛋白結(jié)構(gòu)

對草魚ACC2氨基酸功能性結(jié)構(gòu)域進行了分析，其結(jié)果見圖4。

由圖4可知，草魚ACC2由1個基因編碼，具有3個結(jié)構(gòu)域，分別為BC、BCCP和CT，它們組成ACC2的3個亞基。甘氨酸富集區(qū)(GGGGKG)被認為是ATP的結(jié)合域[11]，草魚ACC2的BC域包含1個ATP結(jié)合位點是Gly371～376，與草魚[10]ACC1、半滑舌鰨[12]和人類[7,13]ATP結(jié)合域完全相同，說明這段序列高度保守。保守的Met-Lys-Met序列被認為是生物素結(jié)合位點[14]。草魚ACC2的BCCP域有2個4肽序列Val-Met-Lys-Met和Arg-Met-Lys-Met分別位于氨基酸殘基的第840～843位點和第1 698～1 701位點。相關(guān)研究表明生物素會上調(diào)ACC2基因在下丘腦的表達，對小鼠給予過量生物素會抑制其食物攝入量[15]。

3.2 草魚ACC2基因的組織表達

草魚ACC2基因在檢測的10種組織中均有表達，其中肌肉中相對表達量最高，肝胰臟中相對表達量最低，白肌中的相對表達量是肝胰臟中的15.3倍(圖1)。據(jù)Abu-Elheiga等[7]報道，ACC2基因主要在人的心臟和骨骼肌有較高的表達量。而相關(guān)研究也表明，大鼠ACC2主要在骨骼肌和心臟等氧化組織中表達[4]。上述研究結(jié)果與本試驗類似，說明草魚與其他哺乳動物一樣，其ACC2基因主要是在肌肉中表達。由于ACC2的產(chǎn)物MA是CPT-Ⅰ的有效抑制劑，ACC2基因缺陷的哺乳動物其心臟和骨骼肌中MA的水平明顯下降，其他的研究也證實ACC2的活性決定心臟中MA的水平，進一步說明ACC2基因可以調(diào)控骨骼肌和心臟中脂肪酸的氧化[16-17]。

BC：生物素羧化酶 biotin carboxylase；BCCP：生物素羧基載體蛋白 biotin carboxyl carrier protein；CT：羧基轉(zhuǎn)移酶carboxyltransferase；ACC2 central region:ACC2中心區(qū)域。

圖4草魚ACC2蛋白的3個結(jié)構(gòu)域

Fig.4 Three domains of ACC2 protein in grass carp

3.3 不同脂肪源飼料對草魚生長指標的影響

本試驗中，各組草魚臟體比差異不顯著，可能是由于飼料脂肪水平較低引起的；魚油組及豆油組的增重率顯著高于豬油組，飼料系數(shù)則是豬油組顯著高于魚油組和豆油組，說明魚油和豆油的促生長效果較好且兩者無顯著差異，它們是草魚良好的脂肪源，豬油不適合單獨作為草魚的脂肪源。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，以魚油、豆油和棕櫚油為脂肪源分別飼養(yǎng)牛蛙，它們的增重率均較高且三者間無顯著差異，但均顯著高于以家禽脂肪和豬油為脂肪源的牛蛙。陳濤等[19]在飼料中分別添加4%豬油、4%豆油、4%豆油-魚油混合物和4%魚油為脂肪源飼喂紅羅非魚稚魚60 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豆油組和豆油+魚油混合物組紅羅非魚稚魚的末均體重和增重率顯著高于豬油組，豬油組飼料系數(shù)顯著高于其他3組，豆油組魚體的生長性能最好，肝體比在各組間無顯著性差異，由此表明豆油是紅羅非魚稚魚良好的脂肪源。成永旭等[20]分別采用豆油和豬油作為草魚脂肪源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬油組草魚肝胰臟和肌肉中脂肪含量最高，腸系膜脂肪積累也最多，且肝胰臟的形態(tài)已有脂肪肝病變傾向，而豆油組草魚肝胰臟形態(tài)正常，說明以豆油為草魚脂肪源優(yōu)于豬油。劉瑋等[21]分別以魚肝油、豆油、菜油、豬油和混合油為脂肪源配制飼料飼喂草魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)混合油組及魚肝油組草魚生長效果最好，相對增重率和飼料系數(shù)最低，豆油組及豬油組的生長狀況次之，上述研究與本試驗結(jié)果基本一致。

3.4 不同脂肪源飼料對草魚肝胰臟和肌肉中及饑餓再投喂對草魚肝胰臟中ACC2基因表達的影響

本試驗以魚油、豆油和豬油為脂肪源，飼養(yǎng)草魚12周，探究ACC2基因在草魚肝胰臟和肌肉中的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組草魚肝胰臟及肌肉ACC2 mRNA的相對表達量均無顯著差異(圖2)，說明ACC2在草魚體內(nèi)表達是相對穩(wěn)定的，不受飼料脂肪種類的影響。到目前為止，分析魚類在投喂不同脂肪源飼料后體內(nèi)ACC2 mRNA相對表達量變化的研究相對較少。據(jù)Olson等[22]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠骨骼肌中ACC2基因后對其體重、食物攝入量以及體組成沒有產(chǎn)生顯著影響，同時發(fā)現(xiàn)小鼠骨骼肌中丙二酰輔酶A總量和脂肪酸氧化率也沒有發(fā)生顯著變化，這說明小鼠體內(nèi)發(fā)生了代謝補償，ACC2基因缺失對能量平衡的影響較小。對雄性大鼠的研究發(fā)現(xiàn)其骨骼肌脂肪酸氧化與ACC2基因的磷酸化沒有直接的相關(guān)性[23]。Torstensen等[24]以毛鱗魚油、棕櫚油、葵花籽油和混合油(毛鱗魚油∶葵花籽油=1∶1)為脂肪源飼喂大西洋鮭，發(fā)現(xiàn)不同脂肪源飼料對鮭魚肌肉和肝臟中脂肪酸β氧化及鮭魚的生長沒有產(chǎn)生顯著影響，從側(cè)面驗證了本試驗中不同脂肪源飼料對草魚肌肉中ACC2基因表達無顯著影響的結(jié)果。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，飼喂不同脂肪源飼料對草魚肝胰臟中ACC1基因表達也無顯著影響[10]。

本研究中，在饑餓再投喂12 h后草魚肝胰臟中ACC2 mRNA的相對表達量顯著增加，喂食24 h后ACC2 mRNA的的相對表達量又顯著下降(圖3)。Oh等[25]研究發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟中ACC2 mRNA的相對表達量在喂食后12 h時出現(xiàn)顯著增加，再投喂24 h后也顯著增加，這些結(jié)果說明大鼠ACC2基因的表達在轉(zhuǎn)錄水平受調(diào)控。上述研究與本試驗結(jié)果存在部分差異，可能是由于物種不同造成的。據(jù)Ryu等[26]報道，饑餓再投喂高脂飼糧后小鼠肝臟中ACC1 mRNA的相對表達量顯著升高。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)雞在饑餓再投喂2 h后，其肝臟中ACC1和脂肪酸合成酶基因mRNA的相對表達量顯著上升，而與脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT-Ⅰ mRNA的相對表達量顯著下降[27]，而本試驗中草魚肝胰臟中ACC2 mRNA的相對表達量在饑餓再投喂0～6 h內(nèi)無顯著差異，說明在此期間草魚肝胰臟中脂肪酸的合成占主導地位。

4 結(jié) 論

① 本試驗從草魚肝胰臟和心臟混合組織中克隆出了ACC2基因全長cDNA，主要的功能位點ATP結(jié)合位點、生物素結(jié)合位點與其他脊椎動物相比基本保守。

② 草魚ACC2基因主要在肌肉等脂肪分解活躍的組織中表達。

③ 投喂不同脂肪源飼料對草魚肝胰臟中ACC2 mRNA的相對表達量無顯著影響。

④ 饑餓再投喂后，肝胰臟中ACC2 mRNA的相對表達量在投喂12 h后最高。

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