高脂血癥奶牛乳腺組織中脂代謝相關生化指標和基因表達的變化

明鵬飛 黃瑩瑩 鄒蘇萍 董妍麗 聶星燦 馮士彬 王希春 程建波 李錦春 吳金節(jié) 李 玉

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036)

奶牛乳腺是奶牛特有的器官，其血液供應極為豐富，乳腺上皮細胞從血液中吸收乳前體物質(zhì)并將其轉化為乳糖、脂肪和蛋白質(zhì)，乳腺上皮細胞是一個重要的“生物工廠”，只有深入了解奶牛乳腺的代謝模式，才能對乳腺主要營養(yǎng)物質(zhì)的合成和分泌進行合理的調(diào)控[1]。脂肪酸是奶牛乳腺營養(yǎng)物質(zhì)中重要的組成部分，乳脂中超過95%的脂肪酸以甘油三酯(TG)的形式存在，其余以磷脂、膽固醇酯、甘油二酯、甘油一酯和游離脂肪酸形式存在[2]。在奶牛生產(chǎn)中，由于妊娠和泌乳的需要，容易造成泌乳初期機體的能量負平衡(NEB)，NEB直接導致低血糖，使奶牛體內(nèi)胰高血糖素含量顯著升高，促進脂肪的分解，導致非酯化脂肪酸(NEFA)濃度的增加和活性氧(ROS)水平升高。當大量的NEFA進入肝臟時，超過了肝臟的氧化能力，多余的NEFA經(jīng)不完全氧化產(chǎn)生酮體[β-羥丁酸(BHBA)、乙酰乙酸(ACAC)及丙酮]，引發(fā)奶牛酮病和脂肪肝，進一步促進營養(yǎng)代謝紊亂性疾病的發(fā)生[3-5]。眾多研究已經(jīng)證明，脂肪肝和酮病等營養(yǎng)代謝紊亂性疾病的發(fā)生與奶牛能量代謝紊亂有關，能量代謝紊亂導致機體免疫功能和炎癥應答能力下降，對疾病的易感性增強[6-9]。高脂血癥是指體內(nèi)血漿脂質(zhì)代謝異常，主要指血漿總膽固醇(TC)、TG和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量升高以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量降低[10]。近年來，高脂血癥及相關疾病的發(fā)病率不斷升高，深入探討高脂血癥發(fā)病的分子生物學機制，為臨床高脂血癥的治療提供試驗依據(jù)顯得尤為重要[11-12]。因此，本試驗利用全自動生化分析儀檢測血清生化指標和乳腺脂代謝指標，蘇木精-伊紅(HE)染色和油紅O染色后觀察乳腺組織病理形態(tài)學變化，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測乳腺脂組織中脂代謝相關基因的表達，揭示奶牛高脂血癥發(fā)生機理，為臨床高脂血癥引起的奶牛乳品質(zhì)下降提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)

奶牛由安徽省某奶牛場提供，根據(jù)血液脂代謝檢測結果，從中篩選6頭正常和6頭高脂血癥荷斯坦奶牛，所選奶牛年齡、胎次相近，預產(chǎn)期相近，生理狀態(tài)相近。采用全混合日糧(TMR)飼喂奶牛，根據(jù)奶牛的營養(yǎng)需求配制試驗飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 血液和組織樣本的采集

于清晨空腹時選取12頭奶牛，尾靜脈采集5 mL非抗凝血，4 ℃靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，收集血清，分裝于2 mL離心管，-20 ℃冷凍保存，待測血清生化指標。血清生化指標的檢測結果如表2，將6頭血清TG和TC含量高于正常范圍的奶牛作為高脂組試驗動物，將另外6頭血清TG和TC含量在正常范圍內(nèi)的奶牛作為正常組試驗動物。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1)每千克預混料含有Contained the following per kg of the premix：VA 200 000 IU，VD 70 000 IU，VE 1 000 IU，F(xiàn)e 2 000 mg，Cu 600 mg，Zn 2 400 mg，Mn 1 300 mg，I 6 mg，Se 17 mg，Co 7 mg。

2)泌乳凈能為計算值，其他為測定值。NELwas a calculated value, while the others were measured values.

采血結束后將12頭奶牛頸靜脈放血致死，沿腹中線切開，剖開乳腺，切取部分乳腺組織，生理鹽水沖洗后迅速置于10%中性甲醛溶液中固定，以便后續(xù)做HE染色和油紅O染色。其余部分迅速置于液氮中冷凍，之后保存于-80 ℃冰箱待測乳腺組織中脂代謝相關基因的相對表達量。

表2 血清中生化指標檢測結果

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表4和表5同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 4 and Table 5.

1.3 乳腺組織中脂代謝相關生化指標檢測

取乳腺組織100 mg液氮研磨，在研磨后的粉狀乳腺組織加入庚烷-異丙醇-吐溫20抽提液(3.00∶2.00∶0.01)5.01 mL，1 800×g、4 ℃離心10 min，收集上清液[13]，采用全自動生化分析儀檢測乳腺組織中TC、TG、HDL-C、LDL-C和VLDL的含量。

1.4 乳腺組織HE染色觀察

將固定的乳腺組織取出，流水沖洗24 h，依次進行70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精脫水，時間均為1 h，二甲苯透明、浸蠟包埋、切片(切片厚度為5 μm)、展片、烤片后，用二甲苯脫蠟，然后用100%、95%、80%、70%梯度酒精復水，時間均為5 min，蘇木精染色、70%鹽酸酒精分色、伊紅復染后，70%(1～3 min)、80%(1～3 min)、95%(3 min)、100%(5 min)梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹脂膠封片，最后顯微鏡下觀察乳腺組織結構病理變化。

1.5 乳腺組織油紅O染色觀察

飽和油紅O原液按3∶2(油紅O∶蒸餾水)加入蒸餾水，混勻，室溫放置5～10 min，濾紙過濾后備用。將置于-80 ℃超低溫冰箱中保存的乳腺組織樣品取出，放入-20 ℃冰箱中緩沖30 min后，再置于含有OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋劑的冷凍組織切片機上進行切片，調(diào)整切片厚度為5～8 μm[14]，自然晾干后用甲醛-鈣固定10 min、蒸餾水充分洗滌、60%異丙醇浸洗、油紅O染液染色10 min、60%異丙醇分化至間質(zhì)清晰、蒸餾水清洗、Mayer蘇木素復染、蒸餾水再次清洗、甘油明膠封片，之后顯微鏡下觀查乳腺組織結構病理變化。

1.6 乳腺組織中脂代謝相關基因qRT-PCR檢測

取凍存乳腺組織100 mg，加入液氮研磨成粉末后，利用Trizol Reagent快速提取試劑盒提取乳腺組織總RNA。利用Invitrogen反轉錄試劑盒進行反轉錄。將反轉錄產(chǎn)物保存于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中奶牛乳腺脂代謝相關基因序列，采用Primer 5.0軟件設計引物，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，利用qRT-PCR法檢測脂代謝相關基因的相對表達量，結果以2-ΔΔCt表示。具體引物序列見表3。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行Student’st檢驗，Duncan氏法進行組間多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，所有試驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差(mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 奶牛乳腺組織中脂代謝相關生化指標檢測結果

如表4所示，與正常組相比，高脂組奶牛乳腺組織中TC、TG和VLDL的含量顯著升高(P<0.05)，HDL-C的含量呈降低趨勢，LDL-C的含量呈升高趨勢，但差異均不顯著(P>0.05)。

表3 qRT-PCR引物序列

表4 奶牛乳腺組織中脂代謝相關生化指標檢測結果

2.2 奶牛乳腺組織HE染色鏡檢結果

如圖1所示，HE染色可見，正常組(圖1-A、圖1-B)乳腺腺泡結構完整，乳腺細胞排列整齊，細胞界限清晰，未見病理學變化；高脂組(圖1-C、圖1-D)細胞核被染成藍色，細胞間質(zhì)被染成紫紅色，腺泡上皮細胞脫落，乳腺腺泡壁明顯增厚，有充血情況，細胞腫脹，部分細胞脂滴增多，部分細胞核染色質(zhì)濃縮、邊移、細胞輪廓不清。

正常組：A，10×；B，40×。高脂組：C，10×；D，40×。下圖同。

Normal group: A, 10×; B, 40×. High lipid group: C, 10×; D, 40×. The same as below.

圖1奶牛乳腺組織HE染色圖片

Fig.1 HE staining pictures for mammary tissue of dairy cows

2.3 奶牛乳腺組織油紅O染色觀察結果

如圖2所示，正常組(圖2-A、圖2-B)可見細胞核明顯呈藍色，紅色區(qū)域較少，主要集中在細胞邊緣，僅有少量脂滴聚集；高脂組(圖2-C、圖2-D)有大片紅色區(qū)域，紅色加深，小葉間結締組織密度增加，乳腺上皮可見脂滴相互融合形成大的空泡狀脂肪細胞，細胞邊界模糊，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊移。

2.4 奶牛乳腺組織脂代謝相關基因qRT-PCR檢測結果

如表5所示，與正常組相比，高脂組奶牛乳腺脂代謝過程中的內(nèi)源合成關鍵酶基因乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)以及活化相關基因乙酰輔酶A合成酶2(ACSS2)、長鏈脂酰輔酶A合成酶1(ACSL1)的相對表達量顯著升高(P<0.05)，攝取和轉運關鍵基因脂肪酸結合蛋白3(FABP3)、分化抗原簇36(CD36)、脂蛋白脂肪酶(LPL)，去飽和酶關鍵基因硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)、脂肪酸去飽和酶1(FADS1)以及乳酯化關鍵基因乙酰甘油磷酸脂酰轉移酶6(AGPAT6)的相對表達量顯著降低(P<0.05)，合成調(diào)控關鍵酶基因固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)以及乳酯化關鍵基因甘油-3-磷酸脂酰轉移酶(GPAM)、磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、二酰甘油脂酰轉移酶1(DGAT1)的相對表達量呈降低趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

高脂血癥是指血液中脂類含量升高的一種代謝性疾病，臨床上常以血脂水平升高及血液外觀異常為特征，表現(xiàn)為血清TC、TG含量升高、HDL含量降低，繼發(fā)肥胖、高血壓、糖尿病等[15-16]。本試驗以高脂血癥奶牛為研究對象，結合血清相關生化指標的檢測、病理形態(tài)學的觀察和乳腺脂代謝相關基因的表達，比較全面地探討了高脂血癥奶牛血清中主要生化指標的變化和乳腺脂代謝相關基因表達的變化。本試驗中，高脂血癥奶牛血清胰島素(INS)、HDL-C的含量呈降低趨勢，血清TC、LDL-C的含量呈升高趨勢，李天宇[17]奶牛高酮血癥的部分血液生化指標特征研究中證實高脂血癥奶牛血液中TC、TG含量升高，這與本試驗的檢測結果是一致的。血液指標被認為是監(jiān)測奶牛群體健康和預測奶牛群體患病風險的主要依據(jù)[18]，本試驗根據(jù)奶牛血清生化指標中INS含量差異和脂代謝指標中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量差異將奶牛分為正常組和高脂組。HE染色病理學觀察可見，正常組奶牛乳腺組織中乳腺腺泡細胞的結構完整，乳腺細胞排列整齊，細胞界限清晰，未見病理學變化，而高脂組奶牛乳腺組織細胞核被染成藍色，細胞間質(zhì)被染成紫紅色，乳腺腺泡上皮細胞脫落，乳腺腺泡壁明顯增厚，有充血情況，細胞腫脹，部分細胞脂滴增多，部分細胞核染色質(zhì)濃縮、邊移，細胞輪廓不清。這與唐海林等[19]利用改良的脂肪染色法觀察到的含有大量脂肪組織的器官HE染色的結果相一致。油紅O染色法主要是將脂肪細胞中的脂肪(主要指TG)特異性地染成紅色，一般來說，脂肪含量越高，油紅O染色時著色就越多，紅色區(qū)域就越大[20-22]。本試驗中，油紅O染色可見正常組奶牛乳腺組織細胞核明顯呈藍色，紅色區(qū)域較少，主要集中在細胞邊緣，僅有少量脂滴聚集，而高脂組乳腺組織有大片紅色區(qū)域，且紅色加深，小葉間結締組織密度增加，乳腺上皮可見脂滴相互融合形成大的空泡狀脂肪細胞，細胞邊界模糊，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊移。這與甄貞等[23]的研究結果一致。qRT-PCR檢測結果顯示，高脂組奶牛乳腺組織中脂代謝攝取和轉運關鍵基因FABP3、CD36，去飽和酶關鍵基因SCD、FADS1，乳酯化關鍵基因AGPAT6的相對表達量顯著降低，活化相關基因ACSS2、ACSL1的相對表達量顯著升高，與張娜等[24]在奶牛乳腺調(diào)控乳脂合成關鍵基因表達分析的試驗中得出的CD36、AGPAT6、DGAT1相對表達量降低的結果相一致。本試驗結果在一定程度上提供了關于高脂血癥奶牛乳腺組織脂代謝相關基因表達變化的信息。但由于基因表達的變化受到多種復雜因素的影響，所以目前仍不能明確解釋這些信息變化之間的相互關系以及各基因表達改變的臨床意義，這些問題尚需在后續(xù)的研究中進一步驗證和探討。

圖2 奶牛乳腺組織油紅O染色圖片

新生畜能量和必需脂肪酸主要來源于乳脂，哺乳期乳腺是合成TG的主要器官。乳脂合成主要包括3個階段，即脂肪酸的合成、TG的合成和脂滴的形成。TG主要貯存于脂肪組織中，在血液中以水溶性脂蛋白形式存在。TG含量的測定主要用于判斷脂代謝狀況，TG含量降低表明肝臟合成和分泌VLDL的能力降低。膽固醇在血液中常與載脂蛋白結合，以可溶性脂蛋白的形式存在，膽固醇含量測定對脂代謝異常和某些肝膽疾病的診斷具有一定意義。當膽固醇相關代謝途徑基因的表達量下降時，機體的代謝處理功能負荷不了膽固醇的產(chǎn)生，可造成膽固醇的分解代謝異常，導致膽固醇堆積，造成血脂水平異常。目前，整個乳脂代謝合成過程的分子機制尚未完全明確。乳脂的合成由多個轉錄因子及其功能基因協(xié)作完成，研究表明，固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白(SREBP)、PPARγ是調(diào)控乳脂合成的重要因子，它們通過結合下游乳脂合成相關基因的核酸序列來啟動這些基因的表達。因此，研究乳脂合成相關基因的表達變化和調(diào)控機理可以完善泌乳機制[25-27]。

表5 奶牛乳腺組織中脂代謝相關基因qRT-PCR檢測結果

本試驗僅選取了奶牛乳腺組織中脂代謝相關的若干個基因作為研究對象，在后續(xù)的試驗中還可以將更多參與脂代謝的相關基因納入研究范圍，結合免疫組織化學法和蛋白質(zhì)免疫印跡反應的檢測以及其他分子生物學技術，從而更全面地研究高脂血癥奶牛脂代謝模式。

4 結 論

高酯血癥奶牛乳腺組織出現(xiàn)大量脂滴蓄積，乳腺上皮細胞形成空泡變性，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊移的典型病理變化；同時，高脂血癥促使奶牛乳腺組織中脂代謝指標發(fā)生紊亂，相關脂代謝基因表達發(fā)生變化，其作用機制可能與高脂血癥促進乳腺脂肪酸合成有關。

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