中藥催情散的急性和亞慢性毒性研究

劉 偉，程 波，蔣瑞東，任書男,祁生旺，李云章，查斯圖

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2 巴林左旗動物衛(wèi)生監(jiān)督所,內(nèi)蒙古 赤峰 025450)

不孕癥作為奶牛場的四大疾病之一，是影響奶牛繁殖和養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要因素，其中卵巢疾病是導(dǎo)致奶牛不孕的主要原因，而奶牛持久黃體是最常見的卵巢疾病[1-2]。持久性黃體可持續(xù)分泌孕酮，抑制卵泡發(fā)育，從而使發(fā)情周期停止循環(huán)而出現(xiàn)乏情現(xiàn)象，導(dǎo)致奶?？諔褧r間及產(chǎn)犢間隔延長[3]，最終降低奶牛場經(jīng)濟(jì)效益。臨床上往往使用外源激素對卵巢疾病進(jìn)行治療，由于激素的長期及不當(dāng)使用，容易造成奶牛性周期紊亂和激素在牛奶中的殘留，進(jìn)而危害人類健康。

由于中藥具有副作用小、藥物殘留量少的特點(diǎn)逐漸受到人們的青睞[4]。閆寶琪等[4]用一定劑量的藿芪灌注液治療奶牛持久黃體取得不錯的療效；梁光華等[5]用中藥促孕散治療奶牛持久黃體，發(fā)情有效率較高，并且治療后奶牛血清中生殖激素、微量元素及白介素也有相應(yīng)的變化。

中藥方劑催情散由“內(nèi)蒙古奶牛不孕癥的病因調(diào)查及中西醫(yī)綜合治療集成”課題組相關(guān)人員根據(jù)中獸醫(yī)理論研制而成，由淫羊藿、陽起石、菟絲子、當(dāng)歸、川芎、熟地等12味中藥組成，具有溫腎補(bǔ)腎、壯陽固精、活血祛瘀、行氣解郁的作用[6]。本試驗(yàn)以小鼠和大鼠為試驗(yàn)動物，研究了催情散的急性毒性和亞慢性毒性，以期對該方劑的安全性進(jìn)行科學(xué)評價，并為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 中藥催情散由淫羊藿、陽起石、菟絲子、當(dāng)歸、川芎、肉蓯蓉、熟地、陳皮、木香、厚樸、香附、甘草等12味中藥組成，中藥材購自內(nèi)蒙古惠豐堂大藥房連鎖有限公司。將催情散制備成含生藥1 g/mL的水煎劑：取催情散散劑315 g，混勻后裝入自制藥袋中，再將藥袋放入煎藥器中，加水浸泡2 h后加熱煮沸。開始用武火，沸騰后改用文火，保持微沸30 min，趁熱倒出藥液，再加水同法煎藥2次。將3次藥液合并后濃縮成1 g/mL，4 ℃密封保存?zhèn)溆谩９辔笗r可依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計的灌胃劑量及體積，對藥液稀釋后使用。

1.1.2 試驗(yàn)動物 健康昆明系雌性小鼠(約5周齡，體質(zhì)量18～22 g)60只及健康雌性Wistar大鼠(約7周齡，體質(zhì)量110～130 g)40只，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格許可證號為SCXK(蒙)2016-0001號。試驗(yàn)前室溫條件下常規(guī)飼養(yǎng)7 d，自由采食與飲水，每周更換3次墊料，觀察健康狀況。

1.1.3 主要儀器及試劑 BC-2800vet全自動血液細(xì)胞分析儀，北京曼程科技有限公司；奧林帕斯(OLYMPUS)系列的全自動生化分析儀、奧林帕斯(OLYMPUS)光學(xué)顯微鏡、SC-04型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，批號：140216017)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號：140116022)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(r-GGT，批號：140916015)、堿性磷酸酶(ALP，批號：140316003)、總膽固醇(TC，批號：141616018)、葡萄糖(GLU，批號：141516018)、白蛋白(ALB，批號：140916013)、總蛋白(TP，批號：140816010)、尿素(UREA，批號：141316019)、肌酐(CREA，批號：141016003)試劑盒，均購自內(nèi)蒙古精壹試劑耗材有限公司。灌胃針、一次性采血針及配套真空采血管，購自內(nèi)蒙古呼和浩特市澤生試劑耗材有限公司。

1.2 半數(shù)致死量(LD50)的測定

取健康雌性昆明小鼠60只，隨機(jī)平均分為6組，1～5組為試驗(yàn)組，第6組為對照組，各組小鼠禁食8 h后灌胃給藥，給藥4 h后復(fù)食，試驗(yàn)組按組間劑量比為1∶0.8 一次性灌胃給藥，第1～5組的給藥劑量分別為20 000，16 000，12 800，10 240和8 192 mg/kg，對照組灌服等體積的自來水，各組小鼠藥液灌胃體積為每20 g體質(zhì)量 0.4 mL。小鼠給藥后常規(guī)飼養(yǎng)7 d，逐日觀察精神、食欲、飲水及其活動情況，記錄中毒癥狀、死亡時間和數(shù)目，并對死亡動物及時剖檢、記錄眼觀病理變化，按改良寇式法計算LD50[7]。如小鼠未出現(xiàn)死亡，且無法繼續(xù)給藥(測不出LD50)[8-12]，需進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)[13]。

1.3 最大耐受量試驗(yàn)

取雌性小鼠 20只 ，分為給藥組與對照組，每組10只，禁食8 h(不禁水)。試驗(yàn)組小鼠于12 h內(nèi)分3次灌服1 g/mL催情散藥液，每次灌胃體積為每20 g體質(zhì)量0.8 mL(最大灌胃體積)；對照組小鼠灌服等體積的自來水。小鼠灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)7 d，逐日觀察小鼠精神、食欲、飲水及其活動情況，記錄小鼠的中毒癥狀、死亡時間及數(shù)目，并計算最大耐受量及耐受倍數(shù)，之后頸椎脫臼處死小鼠并剖檢，觀察2組小鼠的心、肝、脾、胃、肺、腎、卵巢、子宮等器官有無肉眼可見的病理變化[14-15]。小鼠的最大耐受量倍數(shù)=(小鼠耐受藥量/小鼠平均體質(zhì)量)×(奶牛平均體質(zhì)量/奶牛每天用藥量)，其中奶牛平均體質(zhì)量取450 kg/頭，奶牛每天用藥量取臨床推薦量315 g。

1.4 亞慢性毒性試驗(yàn)

取雌性大鼠40只，隨機(jī)平均分為催情散高、中、低劑量給藥組和對照組，高、中、低劑量給藥組灌胃劑量分別為10 000，5 000和2 500 mg/kg，每天1次，對照組每日定時灌服等體積自來水。各組連續(xù)灌胃30 d(每7 d稱一次體質(zhì)量調(diào)整灌胃體積)，整個試驗(yàn)期間，每天早晚觀察并記錄動物的行為情況、外觀體征、有無中毒反應(yīng)以及死亡情況等[16]。給藥期結(jié)束后各組大鼠心臟采血，檢測血常規(guī)和血液生化指標(biāo)。

1.4.1 體質(zhì)量的測定 于灌藥前及給藥第7，14，21，28和30天，測定并記錄大鼠體質(zhì)量[17]。

1.4.2 血常規(guī)及血液生化指標(biāo)的測定 采用全自動血液細(xì)胞分析儀測定血液的主要生理指標(biāo)，包括血紅蛋白(HGB)含量、紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)、白細(xì)胞數(shù)目(WBC)及各類白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞(Lym)、單核細(xì)胞(Mon)、中性粒細(xì)胞(Neu)、嗜酸性粒細(xì)胞(Eo)、嗜堿性粒細(xì)胞(Ba))占白細(xì)胞總數(shù)的比例。分離血清后采用自動血液生化指標(biāo)分析儀測定血液生化指標(biāo)，包括天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(r-GGT)、堿性磷酸酶(ALP)活性及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量和肌酐(CREA-J)、尿素(UREA)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TC)濃度[18-19]。

1.4.3 病理變化觀察及臟器系數(shù)的測定 4組大鼠采血后立即剖檢，觀察心、肝、脾、胃、腎、肺等器官的眼觀病理變化，并對每組大白鼠的心、肝、脾、胃、肺、腎、卵巢、子宮器官稱質(zhì)量后用10%福爾馬林固定，經(jīng)不同梯度酒精脫水、浸蠟包埋后切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察各器官組織病理學(xué)變化[20-23]，計算心、肝、脾、胃、肺、腎、卵巢、子宮等器官的臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)[24]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性比較及統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥催情散的LD50

經(jīng)口1次灌服給藥后，各組小鼠由于灌胃應(yīng)激會呆立2～3 min，之后精神狀態(tài)逐步恢復(fù)正常，活動自如，皮毛光滑，排糞、排尿正常且無異常分泌物，無不良反應(yīng)。連續(xù)觀察7 d，各組小鼠精神、食欲、飲水、活動程度均無異常，經(jīng)大體剖檢和病理檢查，主要臟器無異常變化。由本試驗(yàn)可知，按改良寇式法不能計算出該藥物的LD50(LD50>20 000 mg/kg)，按毒理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)及藥物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)LD50>16 000 mg/kg時，可認(rèn)為該藥物無毒性。由于受給藥體積和藥物濃度的限制，難以測出LD50，故進(jìn)行小鼠的最大耐受量試驗(yàn)。

2.2 中藥催情散的最大耐受量

小鼠于12 h內(nèi)分3次最大體積連續(xù)灌服中藥催情散后，試驗(yàn)組累計藥量達(dá)到120 g/kg，2組小鼠在灌胃后由于灌胃應(yīng)激出現(xiàn)蜷縮呆立、活動減少現(xiàn)象，5 min后活動和飲食情況恢復(fù)正常。經(jīng)7 d觀察未見死亡和異常狀況，剖檢后各器官未出現(xiàn)眼觀病理變化。經(jīng)計算，小鼠(體質(zhì)量20 g/只)的最大耐受藥量為2.4 g/只。小鼠灌服催情散的最大耐受量倍數(shù)=2.4/20×450 000/315=171.5，即按體質(zhì)量計算小鼠1 d最大耐受量是奶牛臨床推薦劑量的171.5 倍，而此劑量下小鼠未出現(xiàn)異常變化，說明中藥催情散按臨床推薦劑量使用對奶牛是安全的。

2.3 中藥催情散的亞慢性毒性

2.3.1 一般狀況觀察及體質(zhì)量的測定 試驗(yàn)期間4個處理組大鼠除在前3 d有灌胃應(yīng)激，但不到3 min就可恢復(fù)正常狀態(tài)。除此之外，整個灌胃期間大鼠精神狀態(tài)、活動程度和飲食情況均無異常變化，排糞、排尿正常，無異常分泌物。由表1可知，3個催情散劑量組大鼠體質(zhì)量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，說明催情散水煎劑對大鼠生長發(fā)育無明顯影響。

表1 不同劑量催情散對大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of different doses on weight of rats g/只

2.3.2 血常規(guī)及血液生化指標(biāo)檢查 由表2，3可知，各組大鼠血常規(guī)和血液生化指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)，說明催情散口服灌藥過程中，對血常規(guī)及肝、腎功能無明顯影響。

表2 不同劑量催情散對大鼠血常規(guī)的影響 Table 2 Effect of different doses on blood routine examination of rats

表3 不同劑量催情散對大鼠血液生化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of different doses on blood biochemical indexes of rats

2.3.3 病理剖檢變化及臟器系數(shù) 由表4可知，4個處理組大鼠各臟器系數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，表明中藥催情散對大鼠各器官組織無實(shí)質(zhì)性損害。

表4 不同劑量催情散對大鼠臟器系數(shù)的影響Table 4 Effect of different doses on organ coefficients of rats %

2.3.4 組織病理學(xué)變化 將催情散高、中、低劑量組和對照組大鼠各組織于光學(xué)顯微鏡(400倍)下觀察，其中高劑量組和對照組大鼠心、卵巢的觀察結(jié)果見圖1。

A.高劑量組:箭頭示心肌纖維壞死；B.對照組:上方箭頭示間質(zhì)血管出血，下方箭頭示心肌纖維壞死;C.高劑量組:卵泡結(jié)構(gòu)清晰無病變；D.對照組:卵巢髓質(zhì)皮質(zhì)無異常變化A.High dose group:the arrow shows myocardial fiber necrosis;B.Control group:the above arrow shows interstitial vascular hemorrhage,and the bottom arrow shows myocardial fiber necrosis;C.High dose group:follicle structure clearly no pathological changes;D.Control group:no abnormal change in ovarian medulla and cortex圖1 催情散高劑量組和對照組大鼠心臟、卵巢的切片觀察結(jié)果(HE染色，×400)Fig.1 Heart and ovarian slice observation of mice in high dose group and control group (HE stain，×400)

顯微觀察顯示，各組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，心內(nèi)膜、心外膜結(jié)構(gòu)清晰，有部分心肌纖維壞死、間質(zhì)血管出血，這是大鼠心臟采血所致；肝小葉由以中央靜脈為中心放射排列的肝板組成且肝細(xì)胞完整，肝小葉間的界限可以分清但不明顯，小葉內(nèi)及匯管區(qū)未見壞死和炎性細(xì)胞浸潤，膽管未見異常；脾臟實(shí)質(zhì)無異常變化，白髓、紅髓及小梁、淋巴小結(jié)和靜脈竇結(jié)構(gòu)清晰可見，未見明顯異常變化；肺內(nèi)支氣管、肺泡結(jié)構(gòu)清晰完整，各級支氣管及周圍肺泡間隔未見變性壞死，支氣管腔及肺泡腔內(nèi)未見炎性滲出物；腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，腎單位清晰可見，腎小球及腎小管未見異常變化，腎小囊腔內(nèi)未見炎性滲出物和細(xì)胞浸潤，近曲、遠(yuǎn)曲小管及集合管結(jié)構(gòu)完整，未見異常變化；胃組織的黏膜層完整，黏膜下層、肌層組織清晰且未見異常變化，表層黏液細(xì)胞、頸黏液細(xì)胞及主細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，未見炎性變化；子宮組織完整，子宮內(nèi)膜及內(nèi)膜腺未見異常變化，子宮肌層未見壞死，血管層內(nèi)未見充血等異常變化；卵巢髓質(zhì)、皮質(zhì)形態(tài)完整，卵母細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、放射冠及顆粒細(xì)胞清晰可見，未見異常變化，部分大鼠卵巢皮質(zhì)部可見完整的黃體組織，說明本試驗(yàn)中藥對大鼠的主要臟器和靶器官無毒性作用。

3 討 論

3.1 中藥催情散的急性毒性評價

急性毒性是新藥安全性評價的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，急性毒性試驗(yàn)因受藥液質(zhì)量濃度及灌胃體積的影響，無法計算出該藥物的LD50，按毒理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)及藥物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，LD50>16 000 mg/kg時可認(rèn)為該藥物無毒性[25]，據(jù)此可判斷催情散無毒。根據(jù)中國新獸藥研發(fā)規(guī)范與申報指南，對無法測出LD50的藥物需分析其最大耐受量，一般檢測動物單次或一天內(nèi)2～3次服用最大劑量藥物后的反應(yīng)[15]。本試驗(yàn)中，小鼠經(jīng)3次最大劑量藥液灌服后的累積劑量達(dá)到120 g/kg，并且2組小鼠1周內(nèi)未見異常變化，剖檢后各臟器均無眼觀病理變化。按體質(zhì)量計算小鼠1 d最大耐受量是奶牛每天臨床推薦劑量的171.5倍，而此劑量下小鼠未出現(xiàn)異常變化，說明中藥催情散按臨床推薦劑量使用對奶牛是安全的[26]。

3.2 中藥催情散的亞慢性毒性評價

本藥物的亞慢性毒性評價以連續(xù)30 d灌服不同劑量催情散后大鼠的反應(yīng)和相應(yīng)指標(biāo)變化為依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，3個劑量組大鼠的體質(zhì)量、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)及臟器系數(shù)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，各臟器除了因心臟采血導(dǎo)致部分心肌纖維壞死和間質(zhì)血管出血外，再無其他異常變化,表明該藥物按臨床推薦劑量使用不會對受試動物產(chǎn)生慢性毒性作用。

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