羽毛降解桿狀鏈霉菌S-28遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立與優(yōu)化

張晉龍，馬怡茗，舒?zhèn)W(xué)，李曉霞，柯 欣，顏 華，賈良輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展促進(jìn)了家禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；a(chǎn)，伴隨而來的是家禽養(yǎng)殖場和屠宰場每年產(chǎn)生數(shù)千萬噸的羽毛廢棄物。羽毛廢棄物的傳統(tǒng)處理方法主要為填埋、焚燒，這不僅造成資源的巨大浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。禽類羽毛中蛋白含量極高，一般為75%～90%，而且氨基酸種類齊全，是具有較高營養(yǎng)價(jià)值的飼料蛋白資源。但由于禽類羽毛主要成分是角蛋白，性質(zhì)極其穩(wěn)定且含有豐富的二硫鍵，如未經(jīng)處理，消化道常見酶類(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)很難將其降解[1-2]。近些年，利用微生物降解角蛋白廢棄物引起了人們的廣泛關(guān)注，是資源化利用羽毛廢棄物的重要手段[3]。目前在細(xì)菌、真菌和放線菌中均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了可以降解角蛋白的菌株，其中以芽胞桿菌屬的細(xì)菌居多[4]。由于放線菌可以產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)由于其生活史中營養(yǎng)菌絲的生長特點(diǎn)，使其更有利于侵入羽毛硬質(zhì)角蛋白從而使角蛋白降解，所以羽毛降解放線菌的研究受到了越來越多的重視。

菌株S-28是由西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物資源研究室分離的1株能夠高效降解羽毛的鏈霉菌，根據(jù)菌株的形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列分析，確定其為桿狀鏈霉菌(Streptomycesbacillaris)的一個(gè)菌株;除高效降解羽毛外，菌株S-28還對(duì)多種植物病原真菌有強(qiáng)烈的抑制效果；全基因組測序也表明，S-28含有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇(未發(fā)表數(shù)據(jù))，具有較好的研究價(jià)值。目前，關(guān)于桿狀鏈霉菌(Streptomycesbacillaris)的研究很少，且主要集中在其發(fā)酵條件優(yōu)化及活性物質(zhì)的分離方面。Hu等[5]從StreptomycesbacillarisSNB-019的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了新肽L-O-Lac-L-Val-D-O-Hiv-D-Val，該肽有抑制自噬作用，具有治療腫瘤疾病的潛能。Jeng等[6]從20年普洱茶餅中分離鑒定了StreptomycesbacillarisR9菌株，發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高茶葉中多酚含量，減少DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基。但關(guān)于桿狀鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究尚未見報(bào)道。本研究嘗試通過接合轉(zhuǎn)移的方式將外源基因?qū)氲綏U狀鏈霉菌(Streptomycesbacillaris) S-28，并對(duì)影響接合效率的培養(yǎng)基的種類、MgCl2濃度、熱激溫度、預(yù)萌發(fā)時(shí)間、供受體比例和接合轉(zhuǎn)移時(shí)間等要素進(jìn)行優(yōu)化，為今后該菌株的遺傳改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 羽毛降解桿狀鏈霉菌S-28菌株由西北農(nóng)林科技大學(xué)微生物資源研究室分離保存；大腸桿菌(Escherichiacoli)S17-1為供體菌株；pSET152質(zhì)粒為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭整合型質(zhì)粒，具有安普霉素抗性基因aac(3)IV及噬菌體φC31整合酶基因int的整合位點(diǎn)attp[7]。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌液體培養(yǎng)基為LB，鏈霉菌液體培養(yǎng)基為TSB[8]。鏈霉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基均為MS，孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基為2×YT，具體配方參見鏈霉菌遺傳操作手冊[9]。

1.1.3 試 劑 抗生素紅霉素(Ery)、卡那霉素(Kan)、安普霉素(Apr)和潮霉素(Hyg)，其他生化試劑萘啶酮酸(Nal)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 質(zhì)粒及鏈霉菌基因組提取

大腸桿菌質(zhì)粒提取基本操作參見文獻(xiàn)[10]。鏈霉菌總DNA的提取參照鏈霉菌遺傳操作手冊[9]。

1.3 S-28菌株抗生素耐受性檢測

選取安普霉素、卡那霉素、紅霉素、潮霉素4種抗生素，分別加入MS培養(yǎng)基中，每種抗生素終質(zhì)量濃度分別為0，5.0，10.0，20.0，50.0 μg/mL。劃線接種野生型S-28，28 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后觀察結(jié)果。

1.4 大腸桿菌和桿狀鏈霉菌S-28的接合轉(zhuǎn)移

將整合型質(zhì)粒pSET152用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)S17-1中，得到供體菌株S17-1/pSET152。挑取單菌落，接種于5 mL含有安普霉素50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，按1∶100的體積比轉(zhuǎn)接到50 mL含有相同抗生素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時(shí)離心收集菌體，用等體積不含抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基洗滌菌體3次，將菌體懸浮于500 μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基中。

在長滿桿狀鏈霉菌S-28孢子的MS平板上，用接種環(huán)刮下孢子后接到含有玻璃珠的玻璃瓶中，手動(dòng)或搖床振蕩30 min，用脫脂棉過濾收集S-28孢子，然后將孢子懸浮于500 μL的2×YT培養(yǎng)基中，熱激10 min后于37 ℃、150 r/min搖床中預(yù)萌發(fā)2.5 h。

將備用的大腸桿菌和預(yù)萌發(fā)好的鏈霉菌S-28孢子懸液按1∶1體積比混合，吸取100 μL涂布于接合培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)16～20 h后，用一定質(zhì)量濃度Apr(≥10 μg/mL)和Nal(≥25 μg/mL)覆蓋，28 ℃培養(yǎng)3～4 d后長出接合子。

1.5 接合轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證

刮取S-28接合轉(zhuǎn)化子的孢子接種到含有10 μg/mL安普霉素的TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集菌絲體，提取其總DNA作為模板。以野生型鏈霉菌S-28的總DNA為陰性對(duì)照，以pSET152質(zhì)粒為陽性對(duì)照。根據(jù)安普霉素抗性基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物(AprF:5′-CTTCGCATCCCGCCTCTGG-3′和AprR:5′-CAATACGAATGGCGAAAAG-3′)，擴(kuò)增片段大小為750 bp。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

1.6 接合轉(zhuǎn)移體系的優(yōu)化

孢子生長培養(yǎng)基選擇高氏1號(hào)、2CMY、ISP4、GSY、YMS和MS 6種；接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中MgCl2濃度分別設(shè)置為0，10，20，30，40，50 mmol/L；熱激溫度設(shè)置為25，40，45，50，55 ℃；預(yù)萌發(fā)時(shí)間設(shè)置為0，2，4，6，8 h；供受體比例設(shè)置為1∶1，10∶1，100∶1，1 000∶1；接合轉(zhuǎn)移時(shí)間設(shè)置為12，14，16，18，20，22，24 h；篩選轉(zhuǎn)化子的抗性培養(yǎng)基選擇MS(含Apr 10 μg/mL和Nal 25 μg/mL)。除供受體比例優(yōu)化試驗(yàn)中所需供體大腸桿菌數(shù)量從107～1010以10倍遞增外，其他試驗(yàn)中鏈霉菌S-28菌絲體量或孢子量保持107，供體大腸桿菌細(xì)胞數(shù)量保持107，最后以肉眼可分辨的轉(zhuǎn)化子為準(zhǔn)。接合轉(zhuǎn)移效率=接合子數(shù)/孢子量，取3次重復(fù)的平均值。

1.7 接合轉(zhuǎn)移體系復(fù)合最優(yōu)條件驗(yàn)證

將上述試驗(yàn)過程中獲得的各個(gè)優(yōu)化條件，包括培養(yǎng)基的種類、MgCl2濃度、熱激溫度、預(yù)萌發(fā)時(shí)間、供受體比例和接合轉(zhuǎn)移時(shí)間，進(jìn)行復(fù)合最優(yōu)條件遺傳轉(zhuǎn)化體系試驗(yàn)驗(yàn)證，以肉眼可分辨的轉(zhuǎn)化子為準(zhǔn)，接合轉(zhuǎn)移效率=接合子數(shù)/孢子量，取3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 桿狀鏈霉菌S-28的抗生素耐受性

為了建立一個(gè)有效的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，必須首先測定S-28菌株的抗生素耐受性。本研究分別測試了S-28菌株對(duì)紅霉素(Ery)、卡那霉素(Kan)、安普霉素(Apr)和潮霉素(Hyg) 4種抗生素的耐受水平，結(jié)果如表1所示。由表1可知，S-28對(duì)Apr和Kan比較敏感，在含Apr 10.0 μg/mL或Kan 20.0 μg/mL的平板上生長極慢；在含Apr質(zhì)量濃度≥20 μg/mL或含Kan ≥50 μg/mL的培養(yǎng)基平板上，S-28不生長。S-28菌株對(duì)Ery和Hyg不敏感，在50.0 μg/mL Ery或Hyg的平板上生長依然旺盛，因此選擇安普霉素(Apr≥10 μg/mL)或卡那霉素(Kan≥20 μg/mL)作為遺傳操作的選擇標(biāo)記。

表1 羽毛降解桿狀鏈霉菌S-28的抗生素耐受性測定結(jié)果Table 1 Antibiotic tolerance of the feather-degrading strain Streptomyces bacillaris S-28

注：+++．正常生長；++．生長緩慢；+．生長極慢；-．不生長。

Note：+++．Normal growth；++．Slow growth；+．Extremely slow growth；-．No growth．

2.2 桿狀鏈霉菌S-28接合轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定及穩(wěn)定性檢測

pSET152屬于穿梭-整合型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到鏈霉菌S-28后，不會(huì)單獨(dú)存在于細(xì)胞質(zhì)中，而是整合到該菌株的基因組上[7]。隨機(jī)挑選7個(gè)鏈霉菌S-28接合子，提取其基因組DNA，用安普霉素的抗性基因引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR檢測結(jié)果(圖1)顯示，接合轉(zhuǎn)化子及陽性對(duì)照pSET152質(zhì)粒均擴(kuò)增出750 bp左右的條帶，而野生型鏈霉菌S-28 DNA未擴(kuò)增出目的片段，由此證實(shí)pSET152質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入到鏈霉菌S-28中。

為了驗(yàn)證S-28遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的穩(wěn)定性，將經(jīng)PCR鑒定的7個(gè)接合轉(zhuǎn)化子在MS培養(yǎng)基(含Apr 10 μg/mL和Nal 25 μg/mL)上傳5代后，在TSB培養(yǎng)基(含Apr 10 μg/mL)中搖菌培養(yǎng)，提取DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果與第1代接合子的驗(yàn)證結(jié)果一致，表明pSET152在鏈霉菌S-28中能夠穩(wěn)定遺傳。

M1．質(zhì)粒pSET152；M2．野生型S-28；M3．DNA Marker;1～7．鏈霉菌S-28接合轉(zhuǎn)化子M1．Plasmid pSET152;M2．Wild type S-28;M3．DNA Marker;1-7．Exconjugants of Streptomyces bacillaris S-28圖1 鏈霉菌S-28/pSET152陽性接合子的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR validation of positive exconjugants ofS-28/pSET152

2.3 桿狀鏈霉菌S-28遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)化

2.3.1 產(chǎn)孢培養(yǎng)基的選擇 作為接合轉(zhuǎn)移的受體，鏈霉菌孢子的質(zhì)量直接決定接合轉(zhuǎn)移是否能夠成功。為了獲得足量的新鮮孢子，將鏈霉菌S-28接種到多種鏈霉菌常用的產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)6～8 d，觀察菌絲的生長及產(chǎn)孢狀況，結(jié)果表明，該菌在培養(yǎng)3～5 d后開始長出白色的氣生菌絲；培養(yǎng)4～8 d開始產(chǎn)微黃色孢子，同時(shí)伴隨有棕色色素產(chǎn)生。由表2可知，鏈霉菌S-28在MS培養(yǎng)基上生長旺盛。收集孢子稀釋計(jì)數(shù)，計(jì)算每種培養(yǎng)基上所產(chǎn)生的孢子數(shù)量，發(fā)現(xiàn)最佳產(chǎn)孢培養(yǎng)基為MS，因此選擇MS為接合轉(zhuǎn)移最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

表2 鏈霉菌S-28在不同培養(yǎng)基上的生長狀況Table 2 Morphological observation of S-28 cultivated indifferent media

2.3.2 培養(yǎng)基中MgCl2濃度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 有研究表明，MgCl2能夠提高接合轉(zhuǎn)移效率[9,11]，但是不同的鏈霉菌所需的MgCl2最適濃度不同。在本研究中，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0，10，20，30，40，50 mmol/L MgCl2，結(jié)果見圖2。如圖2所示，接合轉(zhuǎn)移效率隨著MgCl2濃度的增加先升高后降低，且MgCl2濃度為10 mmol/L時(shí)，接合轉(zhuǎn)移效率最高；MgCl2濃度繼續(xù)升高，接合轉(zhuǎn)移效率逐漸降低。因此在后續(xù)的優(yōu)化條件試驗(yàn)中，均以含有10 mmol/L MgCl2的MS培養(yǎng)基為接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，以不含MgCl2的MS培養(yǎng)基為篩選轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基。

圖2 MS培養(yǎng)基中MgCl2濃度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.2 Effect of MgCl2 concentration on conjugation efficiency

2.3.3 熱激溫度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 熱激處理被認(rèn)為是供體與受體混合均勻前的預(yù)處理[12-13]。為了探究熱激溫度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響，設(shè)置25，40，45，50，55 ℃ 5個(gè)溫度梯度各處理10 min，結(jié)果如表3所示。由表3可知，接合轉(zhuǎn)移效率隨著熱激溫度的增加先升高后降低，且熱激溫度為40 ℃時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高，達(dá)到(4.32±0.31)×10-5，之后隨著熱激溫度的升高接合轉(zhuǎn)移效率逐漸降低，因此S-28孢子40 ℃熱激10 min時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高。

表3 熱激溫度對(duì)S-28孢子活性和接合轉(zhuǎn)移效率的影響Table 3 Effect of heat treatment of S-28 spores on spore viability and conjugation efficiency

2.3.4 熱激孢子預(yù)萌發(fā)時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 在S17-1/pSET152與S-28接合轉(zhuǎn)移之前，熱激孢子預(yù)萌發(fā)時(shí)間也是影響接合轉(zhuǎn)移效率的參數(shù)，因此在S-28孢子40 ℃熱激10 min后對(duì)預(yù)萌發(fā)時(shí)間也進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，預(yù)萌發(fā)時(shí)間越長，接合轉(zhuǎn)移效率越低。故確定40 ℃熱激10 min且不進(jìn)行預(yù)萌發(fā)處理時(shí)進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。

圖3 熱激孢子預(yù)萌發(fā)時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.3 Effect of incubation time of heat-treated spores onconjugation efficiency

2.3.5 供受體比例對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 供受體比例在鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移過程中是一個(gè)很重要的參數(shù)。在本試驗(yàn)中，以S-28孢子數(shù)量為107保持不變，然后與數(shù)量為107～1010的S-17/pSET152供體按比例混合，檢測接合轉(zhuǎn)移效率,結(jié)果見表4。從表4可以看出，當(dāng)供體菌的數(shù)量為107，能獲得相對(duì)較少的接合子，當(dāng)供體菌的數(shù)量為108，接合轉(zhuǎn)移效率最高,達(dá)到(5.63±0.31)×10-5，比供體菌為107時(shí)提高了10倍，而隨著供體菌數(shù)量的增加，接合轉(zhuǎn)移效率又隨之降低。說明當(dāng)供受體比例為10∶1時(shí)，S17-1/pSET152和S-28接合轉(zhuǎn)移效率最高。

表4 供受體比例對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Table 4 Effect of donor-to-recipient on conjugation efficiency

2.3.6 接合轉(zhuǎn)移時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 供體到受體的接合需要一定的時(shí)間，供受體混勻涂布到接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基MS，經(jīng)過一定的時(shí)間后覆蓋抗生素篩選接合子。如果接合時(shí)間過短，接合轉(zhuǎn)移不能完成，導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移效率較低，但如果接合轉(zhuǎn)移時(shí)間過長，會(huì)出現(xiàn)過多的假陽性。如圖4所示，供體到受體接合12～20 h時(shí)，都可以獲得較多的接合子，其中12～16 h時(shí)差異不是很明顯，18～20 h時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高；接合22～24 h時(shí)鏈霉菌S-28生長過于旺盛，導(dǎo)致陽性接合子難以挑選。因此選擇18～20 h為篩選接合子的最佳時(shí)期。

2.3.7 綜合最優(yōu)條件對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響 綜合最優(yōu)接合轉(zhuǎn)移單因素條件進(jìn)行鏈霉菌S-28和E.coliS17-1/pSET152接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)接合轉(zhuǎn)移效率達(dá)到10-4。

圖4 接合轉(zhuǎn)移時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響Fig.4 Effect of exconjugation time on conjugation efficiency

3 討論與結(jié)論

鏈霉菌是一類高G+C含量的革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的12 000余種天然抗生素中約60%由鏈霉菌產(chǎn)生[14-15]，許多已在人類醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中體現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值。桿狀鏈霉菌S-28除可以高效降解羽毛外，還含有豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，有一定的研究價(jià)值。建立可靠且高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是開展后續(xù)工作的必要前提。

鏈霉菌是一個(gè)高度分化的菌屬，不同菌種之間有很大差異，適用于一種鏈霉菌的轉(zhuǎn)化方法不一定適用于其他鏈霉菌[9,16-17]。鏈霉菌常見的遺傳操作方法有電轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移3種[18]。在建立S-28遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的過程中，也嘗試過電轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，但未獲得成功。本研究在S-28菌株抗生素耐受性測試、產(chǎn)孢培養(yǎng)基和供體菌株選擇的基礎(chǔ)上，通過接合轉(zhuǎn)移的方法，成功建立了S-28的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中隨著MgCl2濃度的增高，接合轉(zhuǎn)移效率先升高后降低，當(dāng)接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基MS中MgCl2濃度為10 mmol/L時(shí)，接合轉(zhuǎn)移效率是不含MgCl2的7～8倍，說明一定濃度的MgCl2可以提高接合轉(zhuǎn)移效率。研究表明Mg2+與膜結(jié)構(gòu)及功能的完整性有關(guān)，在培養(yǎng)基中加入一定量的Mg2+能夠提高接合轉(zhuǎn)移的效率[19]。熱激溫度對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率也有顯著影響，隨著熱激溫度的升高，接合轉(zhuǎn)移效率先升高后降低，在熱激溫度40 ℃時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高，當(dāng)熱激溫度達(dá)到55 ℃并處理10 min后，接合轉(zhuǎn)移效率最低。有研究表明，適度的高溫?zé)峒ぬ幚砜山档图?xì)胞內(nèi)限制酶活性，使得接合轉(zhuǎn)移效率變高[20-21]；而55 ℃的熱激處理使得部分孢子喪失活性，從而降低了接合轉(zhuǎn)移效率。本研究發(fā)現(xiàn)，供受體比例對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率也有影響，供受體比例不同，接合轉(zhuǎn)移效率也不同，且供受體比例為10∶1時(shí)接合轉(zhuǎn)移效率最高。有研究表明，天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)[13]和結(jié)節(jié)鏈霉菌(Streptomycesnodosus)[22]供受體比例不會(huì)影響接合轉(zhuǎn)移效率，但北里孢剛毛菌(Kitasatosporasetae)[23]、林可鏈霉菌(Streptomyceslincolnensis)[24-25]和淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes1628)[26]卻受供受體比例的影響。

綜合各種因素，本研究建立并優(yōu)化了S-28的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：以MS為接合轉(zhuǎn)移最適培養(yǎng)基，MgCl2濃度為10 mmol/L，孢子在40 ℃熱激10 min且不進(jìn)行預(yù)萌發(fā)處理，供受體比例為10∶1，接合轉(zhuǎn)移時(shí)間18～20 h，此條件下轉(zhuǎn)化效率最高達(dá)到10-4。

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