抑制黃曲霉菌的乳酸菌的分離及鑒定

尹 雪，郭雪峰,2，帕提古麗·毛拉紅，劉俊峰,2，張秀萍,2，席琳喬,2

(1 塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾843300)

真菌是一類生命力極強的腐敗微生物[1]，關(guān)于由酵母菌和霉菌污染所導(dǎo)致的飼料損失已有大量報道。目前已經(jīng)確定有超過200種霉菌在特定食品、動物飼料中生長時會產(chǎn)生對人和動物有害的物質(zhì)，主要有黃曲霉毒素類、串珠鐮刀菌素、赫曲霉毒素類、棒曲霉素、單端孢霉烯類和玉米赤霉烯酮6大類[2]。由于這些毒素具有致癌致畸性，對神經(jīng)、肝腎也有毒害作用，因此這些腐敗真菌在造成巨大經(jīng)濟損失的同時，也對公眾的健康構(gòu)成了極大威脅。如發(fā)生在20世紀60年代英國雞場的“火雞X病”，幾個月內(nèi)10多萬只雛火雞相繼死亡，結(jié)果1963年由Spensley證實這種病由黃曲霉菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素B1(AflatoxinB1)引起[3]。國內(nèi)外對抑制黃曲霉毒素進行了大量研究，例如物理方法，包括干燥、冷凍干燥、熱處理、紅外線處理、微波輻射、氣調(diào)儲藏等，或添加化學(xué)防腐劑如乳酸、乙酸、山梨酸、苯甲酸、丙酸等[4-5]。但是這些傳統(tǒng)方法都存在一定的弊端，如物理方法會造成營養(yǎng)成分的損失，化學(xué)防腐劑則會對人和動物的健康及環(huán)境帶來危害，而且隨著化學(xué)防腐劑的大量應(yīng)用，有研究發(fā)現(xiàn)一些真菌已經(jīng)對其產(chǎn)生了抗性，一些酵母甚至可以利用苯甲酸、山梨酸和丙酸這些常用的防腐劑，部分青霉屬的菌株可以在山梨酸鉀存在條件下生長，而一些霉菌具有降解山梨酸酯的能力[6]?，F(xiàn)有研究表明，微生態(tài)制劑具有最小的不良反應(yīng)和最佳的適口性等特點，已成為替代抗生素的主要添加劑；乳酸菌作為微生物來源的添加劑，被公認為是目前最傳統(tǒng)、最安全的添加劑，已被廣泛用于醫(yī)藥、食品和飼料等領(lǐng)域[7]。本研究從新疆傳統(tǒng)發(fā)面面肥中分離篩選出能夠抑制黃曲霉菌生長的乳酸菌，旨在對其生理生化特性及分類地位進行深入研究，進而為改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及抑制黃曲霉菌生長提供乳酸菌資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品與菌種 樣品來源：2016年7月從新疆阿克蘇地區(qū)隨機采集發(fā)面面肥、發(fā)霉花生、發(fā)霉玉米及變質(zhì)青貯飼料樣品。將樣品封存于密封袋中，貼上標簽標明采樣時間和地點后運回實驗室，于4 ℃條件下，由塔里木大學(xué)畜牧科技重點實驗室草食家畜營養(yǎng)研究室保存?zhèn)溆谩?/p>

菌種來源：從發(fā)面面肥樣品中分離獲得乳酸菌，從發(fā)霉花生、玉米及變質(zhì)青貯飼料中分離獲得黃曲霉菌，由塔里木大學(xué)畜牧科技重點實驗室草食家畜營養(yǎng)研究室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：細菌提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、T4連接盒和通用型DNA純化回收試劑盒，均購自天根深化科技有限公司；引物FA-27F:5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAG-TTTGATCCTGGCTCAG-3′，RA-1495R:5′-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTT-GTTACGA-3′，均購自北京英俊生物技術(shù)公司。

主要儀器：超凈工作臺(SW-CJ-2FD，上海博迅實業(yè)有限公司)，電子天平(XP603S，瑞士梅特勒-托利多中國公司)，高壓滅菌鍋(SX-500，上海法潤科學(xué)儀器有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP9162，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，紫外可見光分光光度計(T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，PCR儀(Eppendorf，德國)，離心機(Eppendorf，德國)，旋渦混合器(HMS-350，金壇市科析儀器有限公司)，電泳儀(JY-300C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，凝膠成像儀(GEL DOC XR，北京賽百奧科技有限公司)，pH計(PHSJ-5，上海儀電科學(xué)儀器有限公司)，超低溫冰箱(海爾集團公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸鎂0.05 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 g，硫酸錳0.05 g，碳酸鈣1 g，瓊脂15 g，溶于1 L去離子水，121 ℃滅菌20 min。參考凌代文[8]《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中所描述的配方配制。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂8 g，溶于1 L去離子水，121 ℃滅菌20 min。參考張國華[9]所描述的配方配制。

曲霉菌瓊脂(AFPA)固體培養(yǎng)基：酵母粉20 g，蛋白胨10 g，檸檬酸鐵銨0.5 g，0.2%二氯硝基苯胺1 mL，氯霉素0.1 g，瓊脂15 g，溶于1 L去離子水，121 ℃滅菌15 min。參考李院[10]所描述的配方配制。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)面面肥中乳酸菌的分離與純化 根據(jù)《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[8]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]和《乳酸細菌：基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用》[12]所描述的乳酸菌菌株形態(tài)進行乳酸菌菌株的分離鑒定。無菌操作稱取10 g發(fā)面面肥樣品放入90 mL無菌蛋白胨水中，密封，置于搖床上以120 r/min搖動2 h，吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌蛋白胨水中，漩渦振蕩，依次稀釋成10-5，10-6，10-7，10-84個梯度，分別取4個梯度的菌液100 μL涂布于固體 MRS平板培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)48～72 h。通過觀察菌落顏色、大小、光澤、是否有透明圈等挑取單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，得到純化的單菌株[13-14]。用MRS液體培養(yǎng)基富集(30 ℃培養(yǎng)24 h)，與等體積的甘油混合，封裝，―70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 發(fā)霉花生、 玉米及變質(zhì)青貯飼料中黃曲霉菌的分離與純化 使用曲霉菌瓊脂(AFPA)固體培養(yǎng)基對發(fā)霉花生、玉米及變質(zhì)青貯飼料稀釋液進行分離。無菌操作稱取各樣品10 g放入90 mL無菌蒸餾水中，按1.2.1節(jié)方法稀釋成10-2，10-3，10-4，10-54個梯度的菌懸液，分別取4個梯度的菌懸液100 μL涂布于AFPA固體培養(yǎng)基表面，置于霉菌恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)4～7 d，挑取少許霉菌所產(chǎn)孢子到曲霉素瓊脂(AFPA)固體培養(yǎng)基上進行劃線分離、純化。純化的霉菌單菌落生長4～7 d后，用接種環(huán)挑取少量帶孢子的菌絲，用乳酸石碳酸棉蘭染色，對霉菌的菌體和菌絲進行顯微鏡形態(tài)觀察[15]。挑選AFPA培養(yǎng)基背面呈亮橙色、霉菌孢子呈淡黃色的霉菌孢子進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 霉菌孢子液的制備 將保存?zhèn)溆玫狞S曲霉菌菌株接種在PDA斜面培養(yǎng)基表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d至大量孢子產(chǎn)生，加入5 mL滅菌生理鹽水于斜面試管，渦旋振蕩5 min，用無菌紗布過濾去除營養(yǎng)菌絲體[16]。采用血球計數(shù)板測定孢子濃度，將孢子濃度調(diào)整為105個/mL，備用。

1.2.4 篩選抑制黃曲霉菌活性的乳酸菌 采用雙層平板法[10]篩選對黃曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌。先將MRS固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中作為下層平板，待其凝固后，用接種環(huán)沾取生長至對數(shù)期的乳酸菌菌液在平板上劃2條2～3 cm的平行直線，于37 ℃培養(yǎng)24～36 h至長出菌苔。然后將含有孢子濃度為105個/mL的PDA半固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，覆蓋在含有乳酸菌菌苔的下層培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)48～72 h，檢測乳酸菌生長條帶周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，挑選有抑菌效果的乳酸菌進行后期試驗。同時，本試驗還將具有抑菌作用的乳酸菌菌液以1%接種量，按1∶1比例兩兩組合后進行抑菌試驗。

1.2.5 乳酸菌的生理生化鑒定 乳酸菌的生理生化鑒定包括：產(chǎn)氣試驗、耐酸耐鹽試驗、溫度生長試驗，以及D-葡萄糖、D-麥芽糖、乳糖、D-甘露糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-松二糖、D-松三糖、纖維二糖、木糖醇、D-棉籽糖、D-甘露醇、D-果糖、蔗糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-山梨醇、D-蜜二糖等碳水化合物碳源發(fā)酵試驗[17]。

1.2.6 乳酸菌DNA的提取與鑒定 對具有抑制黃曲霉菌作用的乳酸菌菌液提取基因組DNA[18]。以乳酸菌菌株基因組DNA為模板，利用細菌通用引物FA-27F和RA-1495R，對細菌的16S rDNA進行PCR擴增。PCR擴增程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。用1.0%瓊脂糖凝膠對擴增的PCR產(chǎn)物進行電泳檢測?；厥誔CR產(chǎn)物，連接pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)藍白斑篩選，將陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.7 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用核酸Blast技術(shù)，將所測序列信息與NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫進行對比，獲得與所測序列同源性最高的已知分類地位的菌種。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得已知菌株的16S rDNA基因序列，與所測菌株的16S rDNA序列一起，采用Clustal進行比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株的分類地位[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與純化

試驗所篩選的12株乳酸菌菌株單菌落均為圓形，其中菌株F3菌落表面凹凸不平，淡黃色，邊緣不整齊，質(zhì)地黏稠且半透明；菌株F1、F2、F4、F6、F7、F8、F9菌落均為灰白色，邊緣整齊，質(zhì)地粗糙，無光澤且不透明；菌株F5、F10、F11、F12菌落均為白色，邊緣整齊，質(zhì)地黏稠，有光澤且不透明。所有菌株革蘭氏染色均為陽性，且接觸酶反應(yīng)均為陰性；菌株F1、F2、F4、F5、F7、F9、F11、F12均是球菌，F(xiàn)3細胞形態(tài)呈短桿狀，F(xiàn)6、F8、F10細胞形態(tài)呈長桿狀。

2.2 黃曲霉菌的分離與純化

試驗發(fā)現(xiàn)，在發(fā)霉花生、玉米及變質(zhì)青貯飼料10-3稀釋菌懸液對應(yīng)的平板上，均長出了培養(yǎng)基背面呈亮橙色且具有黃曲霉菌特征的菌落，進一步對其進行菌落特征觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，黃曲霉菌菌落呈放射狀，孢子呈淡黃色，在AFPA培養(yǎng)基上生長，培養(yǎng)基背面呈亮橙色。本試驗從發(fā)霉花生、玉米及變質(zhì)青貯飼料中分離出4株菌落形態(tài)基本一致的黃曲霉菌。

A.黃曲霉菌在AFPA培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)；B.黃曲霉菌在AFPA培養(yǎng)基上的背面照(亮橙色)A.Single colony morphology of Aspergillus flavus on AFPA medium;B.The back photos of Aspergillus flavus on the AFPA medium (Bright orange)圖1 黃曲霉菌的菌落形態(tài)Fig.1 Colony of Aspergillus flavus

2.3 篩選具有抑制黃曲霉活性的乳酸菌

在對黃曲霉菌具有抑制活性的乳酸菌篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3、F11和F12 3株乳酸菌對黃曲霉菌有抑制作用(圖2和表1)。由表1可以看出，與單乳酸菌菌株相比，將具有抑菌作用的3株乳酸菌菌液兩兩混合后其抑菌效果顯著提高，其中F3與F11組合的抑菌效果最好，抑菌區(qū)直徑可達到5.3 cm(圖2-A)，單個菌株中F11的抑菌效果顯著高于其他單個菌株(P<0.05)，抑菌區(qū)直徑達到4.5 cm(圖2-B)。

A.菌株F3與F11菌液混合后對黃曲霉菌的抑制效果；B.菌株F11對黃曲霉菌的抑制效果A.Inhibition effect of hybrid F3 and F11 strains of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus;B.Inhibition effect of F11 strain of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus圖2 乳酸菌對黃曲霉菌的抑制作用 Fig.2 Inhibition of lactic acid bacteria on Aspergillus flavus

乳酸菌Lacticacidbacteria抑菌區(qū)直徑/cmInhibitionzonediameterF32.3±0.14eF114.5±0.46bcF121.8±0.10fF3+F115.3±0.18abF3+F125.0±0.12bF11+F123.0±0.10dF3+F11+F126.2±0.24a

注：同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercases mean significant difference (P<0.05).

2.4 具有抑菌活性乳酸菌的鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 對具有抑菌活性的3株乳酸菌的生理生化指標及碳源利用方式進行鑒定，結(jié)果如表2和表3所示。由表2可以看出， 3株乳酸菌發(fā)酵葡萄糖均不能產(chǎn)氣，為同型發(fā)酵乳酸菌； 3株乳酸菌均能在5 ℃條件下弱生長，在10 ℃條件下除菌株F11生長良好，其余2株菌生長較弱，在40和45 ℃，3株乳酸菌均能良好生長；NaCl為3%和6.5%時3株菌均能良好生長;在pH=3時3株乳酸菌均不能生長,在pH=4時3株乳酸菌均能弱生長，pH值為5～7時3株乳酸菌均能良好生長。由表3可知：3株乳酸菌均可利用D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露糖、纖維二糖、D-甘露醇、D-果糖、蔗糖、D-山梨醇；F3菌株不能利用酵乳糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-松三糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-蜜二糖；F11菌株不能利用酵L-山梨糖、D-松二糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖；F12菌株不能利用L-山梨糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖。

表2 3株乳酸菌生理生化指標的測定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical indexes of lactic acid bacteria

注：“+”表示可以生長，“-”表示不生長，“W”表示弱生長。下同。

Note:“+”Growth,“-”No growth,“W”Weak growth.The same below.

表3 乳酸菌碳源發(fā)酵試驗結(jié)果Table 3 Carbon source test of lactic acid bacteria

2.4.2 16S rDNA序列同源性分析 對具有黃曲霉菌抑制活性的乳酸菌菌株16S rDNA測序后進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株的分類，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，菌株F3與類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)MD9B2的同源性為100%，菌株F11與屎腸球菌(Enterococcusfaecium)V9-156的同源性為100%，菌株F12與乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)25F1的同源性為100%。依據(jù)16S rDNA基因序列的同源性分析，確定菌株F3為類芽孢桿菌，菌株F11為屎腸球菌，菌株F12為乳酸乳球菌。

圖3 菌株F3、F11和F12的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains F3, F11 and F12

3 討 論

本研究所用發(fā)面面肥樣品是從新疆阿克蘇地區(qū)隨機采樣獲得，共篩選出12株乳酸菌菌株，其中球菌8株，桿菌4株，說明球菌是發(fā)面面肥中的優(yōu)勢菌群。本試驗所分離的優(yōu)勢乳酸菌與其他研究者的結(jié)果略有不同。張國華[9]對我國5個不同地區(qū)發(fā)酵酸面團中的優(yōu)勢菌群進行研究發(fā)現(xiàn)，除安徽地區(qū)的優(yōu)勢菌為明串珠菌(Leueonostoe)外，河南、山西、甘肅及黑龍江等地區(qū)均以乳桿菌(Lactobacillus)為優(yōu)勢菌。王雪婷等[20]選取河南周口和山西運城的傳統(tǒng)酸面團進行分離鑒定，結(jié)果顯示其優(yōu)勢菌群為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和面包乳桿菌(Lactobacilluscrustorum)。這可能是由于各地區(qū)發(fā)面面肥的制作工藝和水土環(huán)境具有一定的差異，因而導(dǎo)致細菌組成差別較大。黃曲霉(Aspergillusflavus)主要存在于霉變的谷物、花生、種子及動物飼料中[21]。本研究利用AFPA培養(yǎng)基結(jié)合菌落形態(tài)，從發(fā)霉花生、玉米和變質(zhì)青貯飼料中分離篩選出4株黃曲霉菌，這與雷明霞[22]的研究結(jié)果基本一致。

本研究利用從新疆發(fā)面面肥中分離出的12株乳酸菌進行黃曲霉菌抑菌試驗，篩選出F3、F11和F12 3株對黃曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌,經(jīng)16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，3株乳酸菌分別為類芽孢桿菌(F3)、屎腸球菌(F11)和乳酸乳球菌(F12)。繞勝其等[23]從酸菜、火腿、香辛料等原料中篩選出9株對黃曲霉菌具有較強抑制作用的產(chǎn)芽胞桿菌，這與本試驗所分離類芽孢桿菌的抑菌效果基本一致。相比較而言，目前研究者對于乳桿菌抑菌作用的研究較為深入。Elnezami等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LactobacillusrhamnosusLGG和LC-705對黃曲霉毒素B1(AFB1)有較強的吸附作用，這2株菌分別使AFB1下降54%和44%。Adel Hamidi等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacilluspentosus和Lactobacillusbeveris2株乳酸菌能夠很好地抑制黃曲霉菌的生長。本研究分離出對黃曲霉菌具有抑菌作用的3株乳酸菌，其抑菌有效物質(zhì)還有待進一步研究，才能使其能更好地應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)青貯飼料的制作。

4 結(jié) 論

本研究從采自新疆阿克蘇地區(qū)的發(fā)面面肥樣品中分離出12株乳酸菌，通過黃曲霉菌抑菌試驗篩選出3株對黃曲霉菌具有抑制作用的乳酸菌菌株。將具有抑菌作用的F3、F11和F12 3株乳酸菌菌液以1∶1比例兩兩組合后其抑菌效果顯著提高，其中將3株菌混合后抑菌效果最顯著。經(jīng)鑒定3株乳酸菌分別為類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)(F3)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)(F11)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(F12)。

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