M2型巨噬細(xì)胞在卵巢癌患者腹膜內(nèi)腫瘤血管生成中的作用

降禮均

（內(nèi)江市第二人民醫(yī)院，四川 瀘州 641000）

卵巢癌是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。該病起病較為隱匿，大多數(shù)該病患者在就診時(shí)已處于病程的晚期[1]。近年來的研究表明，卵巢癌患者體內(nèi)M2型巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量與其預(yù)后存在密切的關(guān)聯(lián)[2-3]。在本次研究中，筆者通過對卵巢癌患者腹水中M2型巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮血管的相關(guān)性進(jìn)行研究，探討M2巨噬細(xì)胞在卵巢癌患者腹膜內(nèi)腫瘤血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人單核白血病細(xì)胞株、EA.hy926人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞株由上海中科院提供；胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)液、平衡鹽溶液（HBSS）及細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640由GIBCO公司提供；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）試劑由Sigmg公司提供；結(jié)晶紫染色試劑由碧云天生物技術(shù)公司提供；Transwell遷移小室由Corning公司提供；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的試劑盒由R&D公司提供；Matrigel基質(zhì)膠由BD公司提供。

1.2 方法

1.2.1 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 取EA.hy926細(xì)胞，將其放入濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液中，然后將該培養(yǎng)液置于37℃的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長至對數(shù)期后對其進(jìn)行消化收集。

1.2.2 進(jìn)行細(xì)胞分化 將濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至1×106個(gè)/ml，向其中加入PMA試劑，將其濃度調(diào)整為320 nmol/L后刺激24 h，使細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞（TAP）。待細(xì)胞貼壁后，去除上清液，使用鹽酸緩沖鹽溶液（PBS）對細(xì)胞進(jìn)行充分的潤洗，然后向其中加入濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行24 h的培養(yǎng)，再次去除上清液，并使用無血清的FBS-RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行24 h的刺激培養(yǎng)。收集上清液，將其作為條件培養(yǎng)基（PMAr CM）。

1.2.3 進(jìn)行巨噬細(xì)胞分離 取7例卵巢癌患者的腹水（在其進(jìn)行手術(shù)的過程中用無菌技術(shù)進(jìn)行采集）。對腹水樣本進(jìn)行常規(guī)的離心處理（轉(zhuǎn)速為1200 r/min，處理時(shí)間為15min），收集細(xì)胞沉淀，然后用Ficoll密度梯度法（轉(zhuǎn)速為2000 r/min，處理時(shí)間為20 min）收集中間層單核細(xì)胞。用HBSS對中間層單核細(xì)胞進(jìn)行重懸后，再對其進(jìn)行離心處理，然后用濃度為5%的FBS-RPMI 1640對其進(jìn)行重懸，將其種植在24孔板上，種植的密度為每孔1×106。將24孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4 h，使細(xì)胞貼壁，然后用經(jīng)過預(yù)熱的HBSS對細(xì)胞進(jìn)行3次潤洗，去除懸浮細(xì)胞。向培養(yǎng)箱中加入濃度為10%的FBS-RPMI 1640培養(yǎng)液，進(jìn)行24 h的靜置培養(yǎng)后，收集上清液，將其作為條件培養(yǎng)基（M2 CM）。

1.2.4 進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力（OD值）、遷移數(shù)目及腫瘤血管生成數(shù)量檢測 將生長至對數(shù)期的EA.hy926細(xì)胞種植在96孔板上，靜置8 h，待細(xì)胞貼壁后，去除上清液，向其中加入DMEM培養(yǎng)液，并對細(xì)胞進(jìn)行12 h的同步處理，使參與實(shí)驗(yàn)的所有細(xì)胞均處于相同的增殖時(shí)相。將細(xì)胞分別加入以下四組培養(yǎng)基中，并進(jìn)行48 h的培養(yǎng)：1）DMEM培養(yǎng)基組，將其作為參考組。2）M2 CM組（即M2巨噬細(xì)胞的無血清培養(yǎng)上清），將其作為A組。3）PMAr CM 組（即TAP細(xì)胞的無血清培養(yǎng)上清），將其作為B組。4）腹水組（在術(shù)中收集卵巢癌患者的腹水，經(jīng)離心處理、清除沉淀及培養(yǎng)后，取上清液待檢），將其作為C組。分別采用結(jié)晶紫染色、Transwell小室遷移及小管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)對上述四組培養(yǎng)基中內(nèi)皮細(xì)胞的OD值、遷移數(shù)目及小管形成的數(shù)量進(jìn)行檢測，并對比檢測的結(jié)果。

1.2.5 進(jìn)行VEGF及IL-8含量檢驗(yàn) 用ELISA法對上述四組培養(yǎng)基中VEGF及IL-8的分泌情況進(jìn)行檢驗(yàn)，對比這四組培養(yǎng)基中VEGF及IL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將本次研究中的數(shù)據(jù)均納入SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組不同的培養(yǎng)基中內(nèi)皮細(xì)胞的OD值、遷移數(shù)目及小管形成數(shù)量的對比

與參考組相比，A組、B組及C組內(nèi)皮細(xì)胞的OD值、遷移數(shù)目及小管形成的數(shù)量均較高，P＜0.05。詳見表1。

表1 四組不同的培養(yǎng)基中內(nèi)皮細(xì)胞的OD值、遷移數(shù)目及小管形成數(shù)量的對比 （ ±s）

表1 四組不同的培養(yǎng)基中內(nèi)皮細(xì)胞的OD值、遷移數(shù)目及小管形成數(shù)量的對比 （ ±s）

注：a與參考組相比，P＜0.05。

組別 OD值 遷移數(shù)目 小管形成數(shù)量A組 0.195±0.001a 85.02±1.98a 11.74±0.53a B 組 0.211±0.012a 72.77±6.51a 11.63±0.68a C 組 0.227±0.013a 144.98±10.62a 10.31±0.79a參考組 0.168±0.004 10.24±0.31 5.09±1.05

2.2 四組不同的培養(yǎng)基中IL-8及VEGF分泌量的對比

A組、B組培養(yǎng)基中的EA.hy926細(xì)胞分泌IL-8、VEGF的量均明顯高于參考組，C組培養(yǎng)基中的EA.hy926細(xì)胞分泌IL-8的量也高于參考組，P＜0.05。不過，C組培養(yǎng)基中的EA.hy926細(xì)胞分泌VEGF的量與參考組相比，P＞0.05。詳見表2。

表2 四組不同的培養(yǎng)基中IL-8及VEGF分泌量的對比 （ ±s）

表2 四組不同的培養(yǎng)基中IL-8及VEGF分泌量的對比 （ ±s）

注：a與參考組相比，P＜0.05。

指標(biāo) 培養(yǎng)基 參考組 A組 B組 C組IL-8（ng/L） M2 CM 10.34±5.36 88.62±24.68a 86.76±2195a 36.74±15.62a PMAr CM 104.34±25.74 1673.14±267.61a 1527.62±229.75a 684.62±96.36a VEGF（ng/L） M2 CM 9.97±4.29 34.62±15.62a 1374.62±184.74a 12.36±5.16 PMAr CM 111.64±19.65 486.67±42.98a 1112.36±59.74a 168.34±24.62

3 討論

巨噬細(xì)胞是腫瘤組織微環(huán)境中的一種非常重要的炎癥細(xì)胞，其含量約占瘤間質(zhì)炎癥細(xì)胞總量的30%～50%[4]。該細(xì)胞來自外周血單核細(xì)胞，可在特定的微環(huán)境下分化成M2型巨噬細(xì)胞，且可釋放IL-8、IL-4、TNF-a、EGF、IL-10及TGF-β1等多種因子及基質(zhì)金屬蛋白酶[5-6]，故其在腫瘤的進(jìn)展中具有重要的作用。腫瘤血管生成是指在各種因子的刺激和誘導(dǎo)下，腫瘤組織中成熟血管的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、游走，并生成小血管，從而加快腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。而內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖是小血管生成的基礎(chǔ)。

本次研究的結(jié)果顯示，A組、B組、C組內(nèi)皮細(xì)胞的OD值、遷移數(shù)量及小血管的生成數(shù)量均高于參考組，P＜0.05。這說明，M2型巨噬細(xì)胞可提高內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力及腫瘤血管的生成能力。而且，A組、B組培養(yǎng)基中的EA.hy926細(xì)胞分泌IL-8、VEGF的量均明顯高于參考組，C組培養(yǎng)基中的EA.hy926細(xì)胞分泌IL-8的量也高于參考組，P＜0.05。這說明，M2巨噬細(xì)胞可通過增加IL-8及VEGF的分泌量來加快腫瘤血管的生成。

綜上所述，卵巢癌患者腹水中的M2型巨噬細(xì)胞可通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-8及VEGF等促血管生成因子，增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力和腫瘤血管的生成能力，從而促進(jìn)患者腹膜內(nèi)腫瘤血管的生成。這一研究結(jié)果有助于臨床上進(jìn)一步了解卵巢癌患者腹膜微環(huán)境中的炎癥細(xì)胞和腫瘤血管生成的相互作用，從而為開展卵巢癌的靶向治療提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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