高效液相色譜法同時測定中成藥紅藥片中5種成分

李 敏 ，趙 健 ，白鋼鋼 △

（1．江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300； 2．武警安徽總隊醫(yī)院，安徽 合肥 230000）

中成藥紅藥片由三七、紅花、當歸、川芎、白芷和土 鱉蟲6味中藥組成，具有活血止痛、祛瘀生新功效，臨床主要用于跌打損傷、筋骨淤血腫痛、風濕麻木[1]。方中三七為主藥，可散瘀止血、消腫定痛，臨床主要用于各種內(nèi)、外出血，胸腹刺痛，跌撲腫痛[2]。人參皂苷和三七皂苷是三七的生物活性成分，但在紅藥片部頒標準中無其含量測定項目。三七的含量測定有薄層掃描法、高效液相色譜（HPLC）-蒸發(fā)光散射測定法、HPLC法等，薄層掃描法的精密度和重復性均較差[3]，HPLC-蒸發(fā)光散射測定法在測定過程中不穩(wěn)定。HPLC法更快速，分離效能高，結(jié)果準確可靠，重復性好，應用廣泛，如2015年版《中國藥典（一部）》中，三七藥材的含量測定采用HPLC法測定人參皂苷Rg1，Rb1和三七皂苷R1的含量[2]。目前，關(guān)于紅藥片三七中皂苷類成分的HPLC法檢測分析，大多以4個成分以下居多[4-7]，同時測定5個成分的報道相對較少，缺少對人參皂苷Rd的測定，且目前市場上有三七總皂苷對照品，相對于配制混合對照品，更簡單、方便、快捷。為更好地控制中成藥紅藥片的質(zhì)量，保證臨床用藥的療效，本研究中建立了中成藥紅藥片5種主要生物活性成分的含量測定方法。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括脫氣泵、四元泵、自動進樣器、2489UV紫外檢測器；Empower色譜工作站；8200型超聲波清洗器（功率為500 W，頻率為53 kHz，上?？茖С晝x器有限公司）；Milli-Q型超純水處理系統(tǒng)（美國M ILLIPORE公司）；Mettler AE-200型電子天平(梅特勒公司）；Mettler XS105DU型電子天平（梅特勒公司）。

1．2 試藥

紅藥片（撫順青松藥業(yè)有限公司，批號分別為20161104，20170402，20170521）；三七總皂苷對照品（批號為 110870-201603)，人參皂苷 Rg1(純度為 28．0%)，人參皂苷 Re(純度為 3．8%)，人參皂苷 Rb1(純度為29．7%)，人參皂苷 Rd(純度為 7．3%)，三七皂苷 R1(純度為6．9%），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法

2．1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm ×4．6 mm，3．5 μm）；柱溫：25 ℃；流動相：A 為乙腈溶液，B 為水，梯度洗脫(0～20 min 20%A，20～45 min 20% ～46%A，45～55 min 46% ～55%A，55～60 min 55%A，60～65 min 55% ～20%A，65～80 min 20%A)；流速：0．8 mL ／min；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

取三七總皂苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 1 mL 含三七皂苷 R128 μg、人參皂苷 Rg10．15 mg、人參皂苷 Re 15 μg、人參皂苷 Rb10．12 mg、人參皂苷Rd 30 μg的對照品溶液。取本品10片，研細，混勻，取約0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為53 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和的正丁醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置分液漏斗中，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次（25 mL，15 mL），棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水洗滌 2次（25 mL，15 mL），棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺三七藥材的陰性樣品，按供試品溶液項下方法制備，即得陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：取缺三七藥材的陰性樣品，依法制備溶液并進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果陰性對照品溶液無干擾。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取對照品溶液，分別進樣2，5，8，10，12，15 μL，記錄峰面積，計算回歸方程，詳見表 1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗：取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積值。結(jié)果的 RSD依次為 0．71%，0．23%，0．31%，0．18% ，0．60%(n ＝ 6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2．2項下同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，16，20，24 h 時進樣，記錄峰面積。結(jié)果 5種成分峰面積的 RSD分別為 1．46%，1．08%，1．34%，0．90%，1．88%（n ＝10），表明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號20161104）樣品6份，依法平行制備，測定。結(jié)果，三七皂苷R1及人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd 每 片 平 均 含 量 分 別 為 0．20，0．88，0．096，0．58，0．16 mg， RSD 分別為 2．43% ，1．28% ，1．01%，1．66%，3．69%(n ＝ 6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號20161104）樣品，研細，稱取 6 份，每份約 0．25 g，精密稱定，分別加入三七皂苷 R1(0．070 g／L)、人參皂苷Rg1(0．28 g／L)、人 參 皂 苷 Re(0．039 g／L)、人 參 皂 苷Rb1(0．30 g ／L)、人參皂苷 Rd(0．074 g ／L)的對照品溶液3 mL，依法制備，測定。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2．4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備溶液并測定，按外標校正因子法計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg，n＝4）

3 討論

本研究中所測的人參皂苷類成分，在常溫條件下穩(wěn)定不易分解，可常溫保存，但供試品溶液在蒸干過程中，溫度蒸干，幾乎沒有三七總皂苷成分。三七皂苷類成分的穩(wěn)定性相關(guān)的研究表明，高溫對三七總皂苷的影響較大，在高溫條件下，三七總皂苷極易分解，樣品應密封，陰涼暗干燥處儲存[4,8-9]。

本研究中對流動相系統(tǒng)進行了選擇，分別對乙腈-0．05% 磷酸溶液（20 ∶80）[10]、乙腈 -0．1% 磷酸溶液(22 ∶78)[11]、甲醇 -水（55 ∶45），發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rg1和人參皂苷Re幾乎很難分開，且人參皂苷Rd相對其他成分，極性小，出峰時間比較靠后，洗脫時間長，故應考慮梯度洗脫方法。參考2015年版《中國藥典(一部)》三七藥材含量測定的色譜條件，使用乙腈-水梯度洗脫，結(jié)果人參皂苷Rg1和人參皂苷Re分離度低，且人參皂苷Rd未分離出來。采用人參皂類成分多選用的乙腈-水為流動相[12]，梯度洗脫 115[13]，80，65 min[14]，結(jié)果梯度洗脫80 min時，出峰快，待測組分能和共存組分達到基線分離，基線平穩(wěn)，且色譜峰具有較好的對稱性，故選用80 min的梯度洗脫程序。

色譜條件的考察中，溫度對人參皂苷類成分的影響也很大，溫度高色譜峰會拖尾，溫度低有的色譜峰會有前沿，最終確定色譜柱的最佳溫度為25℃[15]。本研究中選擇的色譜柱是 Waters XBridge C18柱（250 mm ×4．6 mm，3．5 μm），1．0 mL ／min 的流速在梯度洗脫中致色譜柱壓力偏高。通過優(yōu)化試驗，最終采用0．8 mL／min的流速既滿足柱壓又符合分離要求。

為達到讓樣品有更大的提取效率，前處理過程分別對稱樣量和提取方式進行了考察。提取方式分別考察了加熱回流(2 h)和超聲處理2種[16]，發(fā)現(xiàn)超聲處理含量明顯偏高，說明三七總皂苷生物活性成分在前處理過程中應避免高溫加熱過程，故使用超聲處理。分別比較超聲 30，40，60 min，發(fā)現(xiàn)超聲處理 40 min時提取效率最高，故超聲處理 40 min。稱樣量分別稱取約 0．2，0．3，0．4，0．5，0．7，1．0 g 樣品，超聲處理 40 min，結(jié)果稱取約0．5 g時樣品提取效率最佳。

綜上所述，HPLC法同時測定中成藥紅藥片中的三七皂苷 R1及人參皂苷 Rg1，Re，Rb1，Rd 的含量，各成分在80 min內(nèi)檢測完全，方法精密度、準確度，重復性好，對該制劑的質(zhì)量控制具有重要意義。

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