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    畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽工藝分析

    2018-05-22 11:13:22韋忠明
    中國科技縱橫 2018年7期

    韋忠明

    摘 要:當前,我國經(jīng)常會出現(xiàn)濫用抗生素的現(xiàn)象,導致患者的生命安全受到極大威脅,誘發(fā)多種微生物菌株,且在發(fā)明新抗生素的時候,需耗費很長時間,無法滿足當前的發(fā)展需求,因此,為了提升抗生素藥物的安全性,下文針對畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)中的抗菌肽工藝進行分析,以實驗的方式表達,得出準確的結論,以供參考。

    關鍵詞:畢赤酵母基因工程;菌發(fā)酵生產(chǎn);抗菌肽工藝

    中圖分類號:Q789 文獻標識碼:A 文章編號:1671-2064(2018)07-0220-01

    抗菌肽屬于新型的抗菌藥物,屬于具有較大潛力的抗生素替代制劑,當前,我國已經(jīng)研究出將近一千種抗菌肽,每種都具備特殊的抗菌機理,與抗生素相較,不容易產(chǎn)生耐藥性,熱穩(wěn)定較高,因此,需合理使用抗菌肽,代替抗生素藥物。

    1 實驗中的材料與方式

    1.1 材料分析

    本次實驗之前構建了抗菌肽畢赤酵母基因工程菌LY,并使用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為實驗材料。實驗中選擇的試劑為酵母粉、蛋白胨、天門冬氨酸、三氯乙酸、甲醇試劑、氯化鈉試劑與葡萄糖試劑。

    1.2 明確培養(yǎng)基的配方

    在實驗中,主要使用的為酵母種子與固體兩種培養(yǎng)基類型。前者的配方為:酵母粉(1%)、蛋白胨(2%)、葡萄糖(3%),且pH值呈現(xiàn)自然的狀態(tài)。后者培養(yǎng)基的配方為:酵母粉(0.6%)、蛋白胨(1.1%)、氯化鈉(1.1%)、瓊脂粉(2.1%),且pH值呈現(xiàn)自然的狀態(tài)。

    1.3 具體的實驗方式分析

    1.3.1 對菌株的重組進行誘導表達

    可篩選陽性的酵母菌株,將其放置在YPD液體中實現(xiàn)一級培養(yǎng),液體劑量為5ml,溫度為30攝氏度,以每分鐘200r的速度振蕩,在等于2的時候,取出1ml培養(yǎng)液,在YPD中重新培養(yǎng),繼續(xù)振蕩,24個小時之后加入濃度為1.1%的甲醇,并培養(yǎng)48個小時,然后以每分鐘8000r的速度進行離心,時間為10分鐘,針對表達上清液進行全面的收集,并取出的表達上清液,實現(xiàn)抑菌實驗工作。在抑菌實驗中,使用21%的三氯乙酸溶液針對上清液進行沉淀,然后加入4攝氏度左右的注射用水,以每分鐘14000r的速度進行離心,時間為20分鐘,針對沉淀物進行收集,然后放置在0.6ml的PBS溶液中進行處理,在電泳分析的情況下,明確三分子多肽的實際表達產(chǎn)物情況。

    1.3.2 利用瓊脂擴散方式針對抗菌肽的抑菌活性進行測定

    篩選對數(shù)生長期中的大腸桿菌與金色葡萄球菌,并制作成為浮液,各自為15,將其與LB固體培養(yǎng)基均勻攪拌,固體培養(yǎng)基的溫度為56攝氏度,劑量為31ml,然后平鋪在平板中,在溶液凝固之后,在平板上面放置牛津杯,然后將已經(jīng)保存的上清液放置在牛津杯中,劑量為100,在此期間,可以將平板設置在溫度為37.5攝氏度的恒溫培養(yǎng)箱中,待過夜之后,將其與體積相同且空載體轉化的酵母上清液進行隱性對照,在第二天的時候,合理仔細觀察抑菌圈,并記錄大小數(shù)據(jù),確保實驗的準確性。

    1.3.3 針對抗菌肽的表達培養(yǎng)基相關配方進行合理優(yōu)化處理

    本實驗可以使用四個因素、三個水平進行正交實驗,制定完善的設計方案,在正交試驗的過程中,全面觀察培養(yǎng)基中碳源對菌株相關抗菌肽表達方式的影響情況。如果酵母膏的濃度為1%、蛋白胨的濃度為2%,就可以針對谷氨酸與天冬氨酸的實際情況進行分析,了解其對于菌株抗菌肽實際表達的影響情況。

    1.3.4 針對抗菌肽的實際表達條件進行合理的優(yōu)化

    在優(yōu)化抗菌肽實際表達條件的時候,可以使用三種方式。其一,了解培養(yǎng)基的pH值,在充足抗菌肽方面的表達影響情況。其二,了解不同甲醇濃度的表達影響。其三,了解發(fā)酵時間的表達影響[1]。

    2 實驗結果

    2.1 針對抗菌肽進行表達

    在實驗之后可以發(fā)現(xiàn),通過空載體酵母與重組酵母的分析,可以得到上清液蛋白的具體結果,其中,重組酵母上清液中,主要蛋白質條帶分子量在4.1kda左右,而對于空載體的酵母而言,在陰性對照期間,沒有條帶,因此,需合理使用實驗方式。

    2.2 不同碳源的實際影響情況

    在酵母菌抗菌肽表達方面,不同碳源會對其造成不同的影響。在正交實驗的過程中,空白R數(shù)據(jù)為0.07,而葡萄糖R數(shù)據(jù)為0.08,可以說明,葡萄糖碳源對于抗菌肽的表達情況所產(chǎn)生影響很小。對于甘油而言,R數(shù)據(jù)為0.56,屬于幾種碳源中,對抗菌肽表達情況影響最大的元素[2]。

    2.3 谷氨酸與天冬氨酸的實際影響分析

    使用正交實驗方式,針對酵母粉與蛋白胨等進行研究,了解此類有機氮源在酵母抗菌肽表達方面的實際影響情況,可以發(fā)現(xiàn),有機氮源對其產(chǎn)生的影響很小,且在實驗中,可以嘗試添加不同的氨基酸,利用氨基酸的表達方式,協(xié)調天冬氨酸表達,以此提高抗菌肽表達的靈活性。在實驗中可以發(fā)現(xiàn),0.26%谷氨酸制劑與0.6%天冬氨酸制劑會促進抗菌肽的表達,但是,繼續(xù)增加濃度,不會產(chǎn)生明顯的促進效果[3]。且在使用0.26%谷氨酸的時候,抑菌圈的直徑可以達到1.9cm左右,而使用0.6%的天冬氨酸,抑菌圈的直徑在1.75cm左右,且谷氨酸的價格很低,因此,在實際實驗的過程中,可將谷氨酸作為主要的氮源,并將濃度控制為0.26%。

    2.4 表達條件實際優(yōu)化分析

    在使用甲醇材料的時候,需在不同濃度、pH值與發(fā)酵時間的條件之下進行比較與研究,在實驗的過程中可以發(fā)現(xiàn),將酵母菌轉結到培養(yǎng)基(pH5.5)中,將培養(yǎng)時間控制在24小時,之后添加1.5%的甲醇材料,在30攝氏度的空間中培養(yǎng)72小時,可得到最高的抗菌肽表達成效[4]。

    2.5 優(yōu)化之前與之后發(fā)酵液對抑菌活性的影響對比

    在實驗的過程中,需針對培養(yǎng)基的優(yōu)化結果進行對比,可實現(xiàn)檸檬酸銨、蛋白胨與酵母膏之間的發(fā)酵,在了解發(fā)酵工藝條件的情況下,明確最終的結果。在實驗中發(fā)現(xiàn),使用革蘭陽性的金色葡萄球菌進行實驗,優(yōu)化之后的抗菌肽效果比優(yōu)化之前高出57%左右,且在實驗中也可以發(fā)現(xiàn),革蘭陰性大腸桿菌會受到抗菌肽的抑制性影響,且優(yōu)化之后比優(yōu)化之前的效果高出63%左右。

    通過本次實驗,可以了解到革蘭陰性與陽性菌會受到抗菌肽的抑菌作用,屬于廣譜的抗菌肽,且在研究中表面,利用發(fā)酵培養(yǎng)基與相關工藝技術的優(yōu)化方式,能夠促進酵母菌株的抗菌肽表達,并形成良好的處理依據(jù),可全面優(yōu)化具體的實驗模式[5]。

    3 結語

    當前,我國經(jīng)常會出現(xiàn)濫用抗生素的現(xiàn)象,導致抗生素的使用效果降低,甚至誘導多種抗生素的抗性菌株增加,且我國在新型抗生素方面,開發(fā)與研究需要很長時間,耗費的成本也很高,無法與耐藥性菌株的臨床發(fā)展速度相較,導致人們的身體健康受到嚴重威脅,這也導致人們在安全驅使之下,迫切追求新型的抗菌制劑。而抗菌肽屬于新型抗菌藥物,可以成為抗生素的替代制劑,當前,我國已經(jīng)得到了抗菌肽的研究成果,并在實際研究中,實現(xiàn)抗菌譜的優(yōu)勢,因此,在臨床治療發(fā)展中具備很高的發(fā)展前景。上述實驗已經(jīng)得出了準確的結論,可以形成借鑒性。

    參考文獻

    [1]郝思怡.金環(huán)蛇抗菌肽Cath-BF在畢赤酵母中的組成型分泌表達[D].廣東藥學院,2015.

    [2]王爾群.雞AvBD6成熟肽在畢赤酵母中的表達及其抗菌活性分析[D].安徽農業(yè)大學,2016.

    [3]魏海婷.AvBD2在畢赤酵母中的組成型表達及其發(fā)酵條件優(yōu)化[D].安徽農業(yè)大學,2015.

    [4]阮海寧.生物轉化法生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝研究[D].浙江大學,2014.

    [5]郭晉霞.重組雙堿基內肽酶在畢赤酵母中的表達制備及酶活鑒定[D].重慶理工大學,2016.

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