高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚含量的研究

任玉琴， 張曉麗

（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州 311199）

肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚屬調(diào)味和誘食類。該類添加劑的適量添加具有掩蓋飼料不良?xì)馕?，增加飼料的適口性，提高采食量，并具有優(yōu)異的抗菌、抗氧化、防霉、防腐等抗菌活性（李京晶，2006）。目前，已有多家企業(yè)生產(chǎn)含4種香味劑的混合型飼料添加劑，深受飼料生產(chǎn)企業(yè)及畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的歡迎。

近年來(lái)，研究報(bào)道較多集中在飼料香味劑對(duì)畜禽采食行為和采食量的影響 （楊晶晶，2016；孫偉明，等 2015；呂繼蓉等，2011）。 董茂峰（2015）和楊希國(guó)（2010）等分別利用氣相色譜和高效液相色譜法測(cè)定了飼料香味劑中的香芹酚和百里香酚；李會(huì)榮（2017）等利用氣相色譜法測(cè)定了飼料香味劑中的麝香草酚，丁香酚和香蘭素。但對(duì)飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚4種有效成分同時(shí)測(cè)定鮮有報(bào)道。本研究建立了采用甲醇提取、高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的含量，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和設(shè)備 安捷倫1260高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器）；Mettler Toledo電子天平；超聲波清洗器。

1.1.2 試劑 乙腈（色譜純），甲醇（分析純）。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 肉桂醛對(duì)照品：純度≥98.9%（Dr.Ehrenstorfer公司）；丁香酚對(duì)照品：純度≥99.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）；香芹酚對(duì)照品：純度≥98.0%（Sigma公司）；百里香酚對(duì)照品：純度99.5%（Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 精密稱取50 mg肉桂醛、500 mg丁香酚、500 mg香芹酚、500 mg百里香酚，分別置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.0 mg/mL的肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，10.0 mg/mL的丁香酚、香芹酚、百里香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。臨用前用甲醇稀釋。

1.1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 準(zhǔn)確移取肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋， 分別配制成肉桂醛濃度為 0.2、1、5、10、20 μg/mL，丁香酚、香芹酚、百里香酚濃度為2、10、50、100、200μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.1.4 市售樣品 混合型飼料香味劑S1（Ⅰ型，批號(hào)：20170801）、S2（Ⅱ型，批號(hào)：20170801）、S3（批號(hào)：17102701）、S4 （批號(hào)：20171031）、S5 （Ⅰ型，批號(hào)：251170320）、S6（Ⅱ型，批號(hào)：20170501）、S7（批號(hào)：20180301）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（粒度為 5μm，柱長(zhǎng) 250 mm，內(nèi)徑4.6 mm）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20μL；柱溫30℃。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述色譜條件上機(jī)測(cè)定，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚分別在290、280、275、275 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。在三種波長(zhǎng)條件下，肉桂醛的響應(yīng)約是其他三種物質(zhì)的10倍，丁香酚的響應(yīng)略大于香芹酚和百里香酚，考慮到香芹酚和百里香酚響應(yīng)小，出峰時(shí)間晚，選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

1.2.3 流動(dòng)相的篩選 本實(shí)驗(yàn)采用甲醇∶水∶冰醋酸（60∶40∶2）和不同比例的乙腈和水作為流動(dòng)相進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，采用甲醇∶水∶冰醋酸（60∶40∶2）作為流動(dòng)相時(shí)，肉桂醛的測(cè)定有雜質(zhì)干擾，無(wú)法分離，采用乙腈和水可以將雜質(zhì)峰與肉桂醛分離，隨著乙腈含量提高，檢測(cè)時(shí)間縮短，香芹酚和百里香酚的分離度也逐漸縮小，最后選擇了乙腈∶水（45∶55）作為流動(dòng)相，使 4 個(gè)有效成分得到較好的分離，分離度R≥2.3。

1.2.4 樣品提取方法的篩選 肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚均易溶于甲醇，因此采用甲醇進(jìn)行提取。取五個(gè)不同廠家的市售樣品，分別采用10、20、30 min進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明在超聲20 min后，有效成分的提取效果不再變化，故選擇甲醇超聲提取20 min為樣品提取方法。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系 取肉桂醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量， 用甲醇配制成濃度為 0.2、1、5、10、20 μg/mL；取丁香酚、香芹酚、百里香酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制濃度為 2、10、50、100、200 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按擬定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果4個(gè)有效成分在兩個(gè)數(shù)量級(jí)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9997），線性最低濃度的信噪比均大于 45（表 1）。

表1 肉桂醛、丁香酚、香芹酚、百里香酚的線性關(guān)系

2.2 準(zhǔn)確度和精密度

2.2.1 空白載體加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)和精密度 飼料香味劑常用的載體為二氧化硅，故本實(shí)驗(yàn)采用在二氧化硅中添加3個(gè)不同濃度水平的4種香味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.4中方法進(jìn)行處理和擬定的色譜條件測(cè)定，結(jié)果4種香味劑的加標(biāo)回收率為96.8% ～102.7%，RSD≤2.0%（表2）。

表2 空白載體加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)和精密度

2.2.2 樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)和精密度 選取市售樣品S1，平行稱取5份，向樣品中加入3個(gè)質(zhì)量濃度的4種香味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為95.0% ～102.6%，RSD為0.5%～1.4%，回收率和精密度均符合要求（表3）。

表3 實(shí)際樣品的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

2.3 樣品測(cè)定 精密稱取S1～S7樣品0.2～2 g（精確至0.0001 g），置于50 mL容量瓶中，加甲醇超聲提取20 min，定容，搖勻，精密量取適量，用甲醇稀釋至濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，過(guò)0.45μm濾膜，按擬定色譜條件測(cè)定，以保留時(shí)間定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，市售產(chǎn)品均含有2種或2種以上香味劑，有效成分分離良好，無(wú)雜質(zhì)干擾，含量為2% ～40%（表4）。

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定飼料香味劑中肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚的高效液相色譜法，并對(duì)色譜條件、樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4種香味劑在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，所建立的方法操作簡(jiǎn)便，方法專屬性強(qiáng)，線性范圍寬，準(zhǔn)確度和精密度符合相關(guān)要求。

表4 市售樣品的檢測(cè)結(jié)果%

參考文獻(xiàn)

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