利用半制備型HPLC分離捆仙七中的非生物堿成分

仙 靚，金 明，馬艷茹，張新新，郭增軍

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

藥材捆仙七是“陜西七藥”中重要的品種，分布在我國(guó)陜西、甘肅、四川、湖北、浙江等省及日本等地[1-6]。據(jù)《中華本草》記載，該藥材具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、消炎止痛和活血止帶等作用，在民間應(yīng)用廣泛[7-9]。一般以全草入藥，味苦微辛，可作為復(fù)方藥治療老年慢性支氣管炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[10-14]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)捆仙七的生物堿成分進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)捆仙七中含有大量孕甾烷型生物堿[15]，但對(duì)其非生物堿成分的研究相對(duì)較少。本文用Semi-preparative HPLC法對(duì)捆仙七非生物堿部分進(jìn)行分離并采用NMR等波譜學(xué)方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1 儀器與試藥

1.1儀器 TM-010超聲波清洗機(jī)(無(wú)錫臺(tái)銘環(huán)?？萍加邢薰?；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；XPE105電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；New Style制備高效液相色譜儀(含N7000二元泵、NV3000 serials紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器、2 mL定量環(huán)和Easy Chrom色譜工作站，江蘇漢邦科技有限公司)；Megres C18色譜柱(10 mm×250 mm，5 μm)；Bruker AM-400 MHz核磁共振光譜儀(美國(guó)Bruker公司)。

1.2試藥 捆仙七藥材采自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院藥圃，經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室鑒定為黃楊科(Buxacea)板凳果屬(Pachysandra)植物頂花板凳果(PachysandraterminalisSieb.et Zucc.)的干燥全草。乙醇，工業(yè)純(西安化學(xué)試劑廠)；石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均為分析純(天津大茂化學(xué)試劑廠)；鹽酸，分析純(武漢市鑫華松化工有限公司)；氘代二甲基亞砜、氘代氯仿和氘代甲醇(美國(guó)Fisher公司)；甲醇，色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑廠)；水為自制雙蒸水；柱層析硅膠和薄層色譜硅膠均為分析純(青島海浪硅膠干燥劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1捆仙七非生物堿部位的制備與分離 將7.5 kg捆仙七藥材粗粉用10倍量乙醇回流提取3次，每次2 h，回收溶劑，得到1.5 kg乙醇提取物浸膏。取浸膏1.0 kg，用10倍量20 mL·L-1的鹽酸進(jìn)行溶解，過(guò)濾，得濾渣(即捆仙七非生物堿部位粗提物)。將上述濾渣用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等不同極性溶劑萃取，將萃取液減壓濃縮后得到石油醚部位(25.3 g)、乙酸乙酯部位(36.2 g)和正丁醇部位(102.3 g)提取物。

取30 g捆仙七乙酸乙酯部位浸膏，用硅膠柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為石油醚-乙酸乙酯(100∶1～1∶10)，收集洗脫液并合并，減壓蒸干溶劑，得到Frac.A1～A10餾分。

將Frac.A5用硅膠柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為石油醚-乙酸乙酯(50∶1～1∶5)，收集洗脫液并合并，得到Frac.A5-3及Frac.A5-4餾分。將Frac.A6用硅膠柱進(jìn)行分離，流動(dòng)相為石油醚-乙酸乙酯(30∶1～1∶5)，收集洗脫液并合并，得到Frac.A6-6及Frac.A6-11餾分。

2.2Semi-preparative HPLC分離純化

2.2.1Frac.A5-3餾分分離 將Frac.A5-3用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。用Semi-preparative HPLC法進(jìn)行分離。色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水(53∶47)；柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物1。見(jiàn)圖1。

圖1化合物1Semi-preparativeHPLC圖

Fig.1 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compound1

2.2.2Frac.A5-4餾分分離 將Frac.A5-4用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。Semi-preparative HPLC進(jìn)行分離。色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水(30∶70)洗脫；柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物2和3。見(jiàn)圖2。

圖2化合物2～3Semi-preparativeHPLC圖

Fig.2 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compounds2-3

2.2.3Frac.A6-6餾分分離 將Frac.A6-6用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。用Semi-preparative HPLC進(jìn)行分離。色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水(20∶80)梯度洗脫；柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：261 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物4。見(jiàn)圖3。

圖3化合物4Semi-preparativeHPLC圖

Fig.3 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compound4

2.2.4Frac.A6-11餾分分離 將Frac.A6-11用色譜甲醇溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾，備用。Semi-preparative HPLC進(jìn)行分離。色譜條件：流動(dòng)相：甲醇-水(60∶40)梯度洗；柱溫：室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。將色譜圖中的主峰收集，回收溶劑，得單體化合物5。見(jiàn)圖4。

圖4化合物5Semi-preparativeHPLC圖

Fig.4 The Semi-preparative HPLC chromatogram of compound5

2.3化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1化合物11H-NMR(400 MHz，DMSO)δppm：10.33 (s，1H)，7.92 (d，J=9.4 Hz，1H)，7.23 (s，1H)，6.79 (s，1H)，6.23 (d，J=9.4 Hz，1H)，3.82 (s，3H)。13C-NMR(100 MHz，DMSO)δppm：56.30 (-OCH3)，103.05(C-8)，109.87(C-5)，110.86 (C-10)，112.02 (C-3)，144.80(C-4)，145.52 (C-6)，149.80 (C-9)，151.39(C-7)，160.99(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的東莨菪亭一致，故鑒定化合物1為東莨菪亭(scopoletin)。

2.3.2化合物21H-NMR (400 MHz，DMSO)δppm：7.61 (1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，6.28 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，6.66 (1H，s，H-5)，4.09 (3H，s，8-OCH3)，3.94 (3H，s，6-OCH3)。13C-NMR(100 MHz，DMSO)δppm：160.7(C-2)，113.5(C-3)，143.9(C-4)，103.2(C-5)，144.6 (C-6)，142.4(C-7)，134.54(C-8)，143.1(C-9)，111.2(C-10)，61.7(8-OCH3)，56.58(6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的異秦皮定一致，故鑒定化合物2為異秦皮定(isofraxidin)。

2.3.3化合物31H-NMR(400 MHz，CDCl3)δppm：3.11(2H，m，H-1，5)，4.74 (2H，d，J=4.3 Hz，H-2，6)，4.25 (2H，dd，J=9.1，6.9 Hz，H-4eq，8eq)，6.82～6.90 (6H，m，aromatic protons)，3.91 (6H，s，-OCH3)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δppm：54.2(C-1，5)，85.9(C-2，6)，71.7(C-4)，132.9(C-1′，1″)，108.6(C-2′，2″)，146.7(C-3′，3″)，145.2(C-4′，4″)，114.3(C-5′，5″)，118.9 (C-6′，6″)，55.9 (2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的松脂醇一致，故鑒定化合物3為松脂醇(pinoresinol)。

2.3.4化合物41H-NMR(400 MHz，MeOD)δppm：7.44 (1H，d，J=1.6 Hz，H-2)，7.42(1H，J=6.0 Hz，H-5)，6.80(1H，dd，J=6.0，1.6 Hz，H-6)。13C-NMR(100 MHz，MeOD)δppm:121.85(C-1)，114.36(C-2)，144.65(C-3)，150.10(C-4)，116.33(C-5)，122.51(C-6)，168.98(-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的原兒茶酸一致，故鑒定化合物4為原兒茶酸(protocatechuic acid)。

2.3.5化合物51H-NMR(400 MHz，MeOD)δppm：6.18 (1H，d，J=2.3 Hz，H-6)，6.38 (1H，d，J=2.3 Hz，H-8)，6.88 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，7.63 (1H，dd，J=8.2，2.3 Hz，H=6′)，7.74 (1H，d，J=1.7 Hz，H-2′)。13C-NMR(400 MHz，MeOD)δppm:146.6(C-2)，135.9(C-3)，175.9(C-4)，161.1(C-5)，97.9(C-6)，164.4(C-7)，93.0(C-8)，156.8(C-9)，103.1(C-10)，120.3(C-1′)，114.6(C-2′)，144.8(C-3′)，114.8 (C-5′)，122.7(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的槲皮素一致，故鑒定化合物5為槲皮素(quercetin)。

3 討論

3.1樣品前處理 為了增加建立Semi-preparative HPLC法的重復(fù)性及穩(wěn)定性，同時(shí)保證從捆仙七中分離得到高純度的化合物以滿足結(jié)構(gòu)解析的要求，在經(jīng)Semi-preparative HPLC進(jìn)一步分離純化前，樣品中對(duì)待分離化合物的干擾雜質(zhì)成分要盡可能少。因此，乙酸乙酯非生物堿部位要經(jīng)過(guò)多次常壓硅膠色譜柱層析，所得不同極性的餾分在薄層色譜上視檢時(shí)，僅能觀察到2到3個(gè)主斑點(diǎn)，或常壓硅膠色譜柱不能將成分再次分離。

3.2優(yōu)化制備色譜條件

3.2.1選擇溶解樣品的溶劑 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、甲醇-水和乙腈-水對(duì)樣品的溶解情況，結(jié)果表明，樣品在甲醇中的溶解度較大。為了降低進(jìn)樣體積和避免色譜峰展寬同時(shí)提高分離目標(biāo)化合物的純度，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇作為溶解樣品的溶劑。

3.2.2流動(dòng)相的選擇 為了使分離目標(biāo)化合物與鄰近雜質(zhì)達(dá)到基線分離，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(含5 mL·L-1冰醋酸)和乙腈-水(含5 mL·L-1冰醋酸)等溶劑系統(tǒng)。結(jié)果表明，捆仙七中的非生物堿成分在甲醇-水系統(tǒng)中具有較好的分離度，且峰形良好，出峰時(shí)間較短，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇甲醇-水作為從捆仙七中分離非生物堿成分的流動(dòng)相。

3.2.3優(yōu)選其他條件 在確定了流動(dòng)相組成后，為了提高效率和保證所分離目標(biāo)成分的純度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還對(duì)其他色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，如流速、洗脫模式和進(jìn)樣量。由于本實(shí)驗(yàn)所用的Megres C18直徑為10 mm，根據(jù)Van Deemter方程得出其最佳流速為4 mL·min-1。本實(shí)驗(yàn)采用紫外檢測(cè)器對(duì)分離化合物進(jìn)行檢測(cè)，為了避免基線漂移影響化合物峰形辨識(shí)，最終選用等度洗脫模式。不同樣品所含雜質(zhì)復(fù)雜程度不同，在滿足目標(biāo)化合物與鄰近雜質(zhì)滿足基線分離的前提條件下，進(jìn)樣量可一直增加。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 由于前期缺少對(duì)捆仙七非生物堿成分結(jié)構(gòu)屬性的信息，本實(shí)驗(yàn)首先用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)分離樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，便于目標(biāo)成分在Semi-preparative HPLC紫外檢測(cè)器上檢出。

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