樂(lè)安眠茶水溶性成分的HPLC指紋圖譜及2種成分的溶出度研究

雷美娜，肖會(huì)敏，何 悅，王四旺

(空軍軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所，西安 710032)

樂(lè)安眠茶又稱(chēng)清心安神桂仁茶，是由炒酸棗仁、茯苓、蓮子、龍眼肉和百合5味藥食同源的中藥制成，主要作用是清心安神。炒酸棗仁為方中君藥，有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神和斂汗生津的功效，含有的酸棗仁總皂苷、總黃酮等成分，具有催眠、鎮(zhèn)靜作用[1]；茯苓可利水滲濕、健脾寧心[1]；蓮子有補(bǔ)脾止瀉、止帶、養(yǎng)心安神、益腎澀精的功效[1]；龍眼肉具有補(bǔ)益心脾、養(yǎng)血安神的功效[1]；百合可養(yǎng)陰潤(rùn)肺、清心安神[1]。酸棗仁總黃酮可明顯抑制小鼠的自發(fā)活動(dòng)，拮抗咖啡因誘發(fā)的小鼠精神運(yùn)動(dòng)性興奮，故認(rèn)為總黃酮系酸棗仁中中樞抑制作用的主要有效成分，其中斯皮諾素為酸棗仁總黃酮中的主要有效成分[2-3]。腺苷是生物小分子化合物，藥用價(jià)值顯著，具有抗病毒、抗凝血、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)和抗心率不齊等作用，為龍眼肉中鎮(zhèn)靜安神的主要成分[4-6]。經(jīng)文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)該茶劑的研究報(bào)道。因此，本文運(yùn)用HPLC法對(duì)該茶劑水溶性成分進(jìn)行分析，建立HPLC指紋圖譜，測(cè)定斯皮諾素及腺苷的含量及不同泡茶時(shí)間二者的溶出度。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Prominence UFLC，島津高效液相色譜儀(配LC-20AD雙泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，SIL-20ACHT自動(dòng)進(jìn)樣器)，LC/labsoluion色譜工作站(日本島津公司)；KQ-300DE數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司)；BSA124S電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2試藥 斯皮諾素對(duì)照品(批號(hào)111869-201203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以95.4%計(jì))，腺苷對(duì)照品(批號(hào)2110879-200202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)以99.7%計(jì))，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；炒酸棗仁、茯苓、蓮子、百合和龍眼肉藥材，均購(gòu)自西安藻露堂集團(tuán)藻露堂藥業(yè)有限公司；樂(lè)安眠茶(批號(hào)：S1：20161106，S2：20161107，S3：20161108，S4：20161109，S5：20161110，S6：20161111，S7：20161112，S8：20161113，S9：20161114，S10：20161115)，由陜西含光生物科技有限公司研制并提供；乙腈、甲醇，色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司；超純水，純水儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 nm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：甲醇(A)-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(B)(5∶95),高壓梯度洗脫程序：0～10 min，B 95%→90%；10～60 min，B 90%→40%；60～65 min，B 40%；65～65.1 min，B 40%→0%；65.1～70 min，B 0%；70～70.1 min，B 0%→95%；70.1～75 min，B 95%，記錄時(shí)間為60 min。流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取斯皮諾素對(duì)照品和腺苷對(duì)照品11.01和5.12 mg，置于同一25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液 取3袋樂(lè)安眠茶劑，混合并研細(xì)，精密稱(chēng)取4.5 g，置于100 mL的溫水中超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液

2.2.3.1酸棗仁陰性對(duì)照溶液 按照處方比例精密稱(chēng)取缺酸棗仁的陰性對(duì)照茶劑4.5 g，置于100 mL溫水中，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3.2龍眼肉陰性對(duì)照品溶液 按照處方比例精密稱(chēng)取缺龍眼肉的陰性對(duì)照茶劑4.5 g，置于100 mL溫水中超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3指紋圖譜的測(cè)定

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取樂(lè)安眠茶劑3袋(批號(hào)20161106)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次50 μL，分別對(duì)各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積進(jìn)行分析。經(jīng)計(jì)算得出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別小于2.45%和2.62%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樂(lè)安眠茶劑3袋(批號(hào)20161106)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別于0，2，4，8和12 h進(jìn)樣，分析共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別小于1.0%和2.00%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取樂(lè)安眠茶劑6份(批號(hào)20161106)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.85%和2.80%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.4指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 取10批供試樣品，分別按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。共選定31個(gè)共有峰，其中峰11確定為腺苷，峰25為斯皮諾素，峰26為蘆丁[7-8]，由于峰26分離度較差，峰面積小，故選用腺苷和斯皮諾素為參比物建立樂(lè)安眠茶水溶性成分的指紋圖譜[9-11]。10批供試品共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.00%，見(jiàn)圖2。符合相關(guān)要求。運(yùn)用文獻(xiàn)要求對(duì)各批樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析[12]，對(duì)選定的31個(gè)共有色譜峰進(jìn)行譜峰匹配，通過(guò)計(jì)算得出樣品指紋圖譜的共有模式，并以此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度為0.993～0.997，結(jié)果表明，各樣品的化學(xué)成分一致性較好。

圖1樂(lè)安眠茶HPLC指紋圖譜

1～31. 特征指紋峰；11.腺苷；25.斯皮諾素(作為參照物的色譜峰)。

Fig.1 HPLC fingerprint of Leanmian Tea

1-31.characteristic fingerprint peak;11.adenosine；25.spinosin(reference peak).

圖210批樂(lè)安眠茶的HPLC指紋圖譜

Fig.2 10 batches of Leanmian Tea HPLC fingerprint

2.4含量測(cè)定

2.4.1線性范圍 精密吸取對(duì)照品溶液0.015，0.030，0.040，0.050，0.060，0.100和0.150 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，分別吸取各質(zhì)量濃度溶液50 μL進(jìn)樣，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得斯皮諾素線性回歸方程y=67 703x-67 517，r=0.999 5(n=2)；腺苷線性回歸方程y=181 733x+5 185.5，r=0.999 4 (n=2)。結(jié)果表明，斯皮諾素和腺苷質(zhì)量濃度分別在3.15～31.50和1.53～15.3 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.2專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 取斯皮諾素對(duì)照品溶液、供試品溶液、酸棗仁陰性對(duì)照溶液、腺苷對(duì)照品溶液和龍眼肉陰性對(duì)照溶液各50 μL，進(jìn)樣，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖3。由圖3可知，分離良好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，結(jié)果表明，該方法專(zhuān)屬性良好。

圖3HPLC圖

A.混合對(duì)照品；B.樂(lè)安眠茶；C.酸棗仁陰性對(duì)照；D.龍眼肉陰性對(duì)照；1.腺苷；2.斯皮諾素。

Fig.3 HPLC chromatograms

A．mixed reference substances；B.Leanmian Tea；C.Ziziphispinosaesemen negative control；D.DimocarpuslonganLour.negative control；1.adenosine；2.spinosin.

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.050 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，分別取50 μL進(jìn)樣，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣5次。測(cè)得斯皮諾素和腺苷峰面積的RSD值分別為0.10%和0.21%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液 0.050 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，分別于0，1，2，4，6，8和12 h進(jìn)樣，每次進(jìn)樣50 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)得斯皮諾素和腺苷峰面積的RSD值分別為0.19%和0.15%。結(jié)果表明，該樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取供試樣品6份(批號(hào)20161107)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得斯皮諾素和腺苷的平均含量分別為0.062 4和0.058 1 mg·g-1，RSD值分別為1.76%和1.09%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收實(shí)驗(yàn) 取供試樣品6份(批號(hào)20161107)，研細(xì)，取3 g，分別精密量取并添加0.40，0.40，0.47，0.47，0.57和0.57 mL混合對(duì)照品溶液(精密稱(chēng)取斯皮諾素和腺苷對(duì)照品10.50和9.50 mg，置于同一25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)表1。結(jié)果表明,該方法回收率良好。

表1加樣回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test

化合物名稱(chēng)取樣量/g原有量/mg添加量/mg測(cè)出量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%斯皮諾素2．90970．180．170．345397．235398．230．923．20810．200．170．365497．29413．12010．190．200．387898．90003．24860．200．200．396698．30003．07150．190．240．425498．08333．27890．200．240．438999．5417腺苷2．90970．170．140．304996．3696．240．893．20810．190．140．325796．933．12010．180．180．355197．283．24860．190．180．361495．223．07150．180．220．392196．413．27890．190．220．399595．23

2.4.7樣品的含量測(cè)定 精密稱(chēng)取10批樣品，分別按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。各批樣品中斯皮諾素和腺苷的平均含量分別為0.083 4和0.059 1 mg·g-1，RSD值分別為1.22%和1.13%。

2.5不同泡茶時(shí)間斯皮諾素的溶出度測(cè)定 測(cè)定方法依據(jù)2.1項(xiàng)下色譜條件與相關(guān)文獻(xiàn)方法[13]：精密稱(chēng)取1袋供試品，加入溫水100 mL浸泡，分別于浸泡5，10，15，30，40，50，60，90和120 min時(shí)取樣，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)線性方程計(jì)算水提液中斯皮諾素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 斯皮諾素溶出情況測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1指紋圖譜的測(cè)定

3.1.1樣品制備方法的選定 為研究樂(lè)安眠茶劑的水溶性成分，通過(guò)篩選得出：精密稱(chēng)取4.5 g該茶劑，用100 mL溫水超聲30 min，過(guò)濾，取濾液，作為供試品，得到的HPLC圖各峰分離度良好，且峰面積在線性范圍內(nèi)，故選定HPLC法作為制樣方法，以此對(duì)樂(lè)安眠茶水溶性成分的指紋圖譜及斯皮諾素、腺苷的含量測(cè)定進(jìn)行研究。

3.1.2流動(dòng)相的選定 曾選用乙腈-水(15∶85)、甲醇-水(20∶80)、甲醇-水(5∶95)作為流動(dòng)相，但分離效果不理想，最終采用甲醇-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，各峰分離度良好，峰形較好[14-15]。

3.1.3波長(zhǎng)的選定 參考文獻(xiàn)[16-18]，參比物斯皮諾素的最大吸收波長(zhǎng)為335 nm，腺苷的最大吸收波長(zhǎng)為260 nm，但在335 nm波長(zhǎng)下出峰較少，且各峰分離度較差，故選用190，245，260，270和300 nm下考察各自波長(zhǎng)下的色譜圖，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)在260 nm波長(zhǎng)下各峰分離度良好，且斯皮諾素和腺苷的峰形較好，故選用260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.4參比物的選擇 本文前期通過(guò)對(duì)31個(gè)共有峰的考察確定了峰11，25和26分別為腺苷、斯皮諾素和蘆丁，但由于蘆丁含量少，且分離度差，故選用腺苷和斯皮諾素作為參比物。

3.1.5其他條件的選擇 將不同柱溫(25，30，35和40 ℃)下的色譜圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)35 ℃時(shí)峰的分離度較好，故確定柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為50 μL時(shí)各峰特征性強(qiáng)，峰形較好，故確定進(jìn)樣量為50 μL[19-20]。

3.2樣品含量測(cè)定 通過(guò)考察可得指紋圖譜測(cè)定中的溶液制備方法及測(cè)定條件對(duì)斯皮諾素及腺苷的含量測(cè)定同樣適用。因腺苷和斯皮諾素的含量穩(wěn)定且分離度較好，故選定腺苷和斯皮諾素2種成分進(jìn)行含量測(cè)定分析。

3.3樣品溶出度測(cè)定

3.3.1樣品制備方法的選定 由于本品為保健茶劑，服用方法為溫水浸泡后飲用，故對(duì)該茶劑不同泡水時(shí)間內(nèi)斯皮諾素和腺苷的含量比較研究時(shí)選用開(kāi)水浸泡的方法。經(jīng)考察得出，1袋樂(lè)安眠茶劑用100 mL開(kāi)水浸泡所得色譜圖各峰分離度較好，故選定該方法為樣品的制備方法。

3.3.2樣品測(cè)定條件的選擇 通過(guò)考察可得指紋圖譜測(cè)定中的方法對(duì)本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)同樣適用。綜上所述，通過(guò)對(duì)10批樣品水溶性成分進(jìn)行相似度計(jì)算，數(shù)值為0.993～0.997。同時(shí)斯皮諾素和腺苷的含量均一穩(wěn)定，表明建立的樂(lè)安眠茶指紋圖譜方法與含量測(cè)定方法有良好的分析評(píng)價(jià)能力，具有簡(jiǎn)便、科學(xué)、可靠等明顯優(yōu)勢(shì)，可用于該茶劑的質(zhì)量控制及調(diào)節(jié)泡茶時(shí)間。

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