檢測藍(lán)耳病病毒的雙抗體夾心ELISA方法研究

張芷寧/遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)信息中心

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及仔豬與育肥豬的呼吸困難為特征的一種傳染病。

目前PRRSV的診斷方法主要有:病毒分離（VI），RT-PCR、免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）等方法。病毒分離耗時(shí)長：RT-PCR及IPMA對操作條件及人員有很高的要求，并且費(fèi)用較高，均不適合在現(xiàn)地推廣。

針對現(xiàn)地中檢測PRRSV的情況，我們開展了建立雙抗體夾心ELISA檢測PRRSV的研究，以抗PRRSV的兔多抗為捕獲抗體，抗PRRSV的N蛋白的單克隆抗體3D6為檢測抗體，建立了雙抗體夾心ELISA方法。并與RT-PCR方法在檢測現(xiàn)地樣品時(shí)進(jìn)行了比較分析，具備較好的敏感性、特異性及重復(fù)性。

一、材料與方法

1．材料。

（1）抗PRRSV的N蛋白單抗3D6及抗PRRSV的兔多抗由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保存。

（2）ProteinG 和ProteinA試劑盒購自GE公司。

2．方法。

（1）抗體制備。將保存的單抗3D6及抗PRRSV的兔多抗分別用GE公司的ProteinG和ProteinA試劑盒進(jìn)行抗體純化，并用BCA Protein Assay kit對抗體濃度進(jìn)行測定。按照測定結(jié)果，將單抗3D6用PBS的濃度調(diào)節(jié)為3ug/ml，用pH9.6的碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)抗PRRSV的兔多抗的濃度為5ug/ml。

（2）ELISA方法。①將用pH9.6的碳酸鹽溶液稀釋后的抗PRRSV兔多抗包被，每孔加入100μl，置4℃過夜，棄去孔中液體。②用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。③加入待檢測樣品和不含病毒的空白對照，37℃孵育1h。④棄去孔中液體，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。⑤加入調(diào)節(jié)好濃度的抗PRRSV的N蛋白的單抗3D6加入孔中，3ug/ml，每孔 100ul，37℃孵育 1h。⑥棄去孔中液體，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。⑦加入酶標(biāo)抗鼠抗體，37℃孵育40min。⑧棄去孔中液體，用含0.5%Tween-20的PBS溶液洗板3次，每次3min。⑨加入TMB（四甲基聯(lián)苯胺）顯色液，每孔 100ul，置 37℃避光放置 15min ；最后加入 2mol/l的H2SO4終止反應(yīng)，測定OD450值。

二、結(jié)果判斷

根據(jù)對30份PRRSV陰性血清的結(jié)果，其均值為0.098，標(biāo)準(zhǔn)差為0.014，得到其陰陽界限值為0.14，因此取OD450≥0.2作為陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

三、方法評價(jià)

1.敏感性試驗(yàn)。將TCID50為107.0的PRRSV陽性樣品進(jìn)行梯度稀釋，檢出的最低濃度定為該方法的靈敏度。

表1 與RT-PCR比較檢測陽性樣品的敏感性結(jié)果

2.重復(fù)性及特異性試驗(yàn)。應(yīng)用該方法對20份陽性病料及10份陰性病料及5份病毒細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行重復(fù)，每次間隔時(shí)間為一周，共進(jìn)行6次重復(fù)，結(jié)果均無差異，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

應(yīng)用該方法對豬的其他病毒病進(jìn)行了特異性檢測，該方法對豬圓環(huán)病毒、豬細(xì)小病毒、豬胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉及豬瘟的檢測均為陰性，證明該方法具有良好的特異性。

四、結(jié)果

應(yīng)用本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法，具有良好的靈敏性和重復(fù)性及特異性。

檢測采集自黑龍江、吉林省5個(gè)大中型豬場豬只的組織臟器、全血樣品共計(jì)128份。并和RT-PCR方法進(jìn)行了比較，敏感性略低于RT-PCR方法，

表2 與RT-PCR比較檢測病料的敏感性結(jié)果

五、結(jié)論

利用該方法對現(xiàn)地樣品進(jìn)行檢測，方法簡便，具有較好的敏感性和重復(fù)性，且無交叉反應(yīng)。方法制備簡單，成本低，對現(xiàn)地人員的操作要求較低，適合在現(xiàn)地進(jìn)行推廣。